文献类型： 中文期刊

作者： 耿伟光 ¹ ; 史成银 ¹ ; 李晋 ¹ ; 黄健 ¹ ; 王秀华 ¹ ; 谢国驷 ¹ ;

作者机构： 1.农业部海洋渔业可持续发展重点实验室中国水产科学研究院黄海水产研究所

关键词： 鳗弧菌;哈维氏弧菌;嗜水气单胞菌;迟缓爱德华氏菌;副溶血弧菌;套式PCR;检测

期刊名称： 农业生物技术学报

ISSN： 1674-7968

年卷期： 2013 年 21 卷 09 期

页码： 1125-1134

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌。本研究在分析了其致病因子基因的基础上,依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,设计了5套特异性的套式PCR引物,并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列;通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化,最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法。优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为:10×PCR Buffer 5μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,Taq酶(2.5 U/μL)0.6μL,10×Primer Mix(2μmol/L)5μL,DNA模板各1μL,灭菌双蒸馏水补足至50μL,反应的退火温度为55℃。实验结果表明:对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌,使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测,得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物,其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA;该方法特异性强,与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应。2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测,确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌,证实该方法具有良好的可靠性和实用性。该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查,也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础。