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CRISPR/Cas9体外酶切检测猪生长抑素基因定点修饰靶点活性的研究

文献类型： 中文期刊

作者： 李晓敏 1 ; 任红艳 2 ; 毕延震 1 ; 刘西梅 3 ; 郑新民 3 ;

作者机构： 1.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所动物胚胎工程及分子育种湖北省重点实验室

2.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所

3.湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

关键词： 猪;生长抑素基因;Cas9酶;单链导向RNA(sgRNA);体外转录

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2016 年 43 卷 01 期

页码： 31-38

收录情况： 北大核心

摘要： 本试验旨在通过CRISPR/Cas9体外酶切法检测猪生长抑素(SST)基因定点修饰靶点的活性。试验设计5个长20bp的单链导向RNA(sgRNA),即SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g2、SST-sgRNA-g3、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5。化学合成sgRNA寡核苷酸序列,将寡核苷酸序列连接到可同时表达Cas9和sgRNA的质粒中,挑选正确克隆的质粒作为模板进行体外转录形成SST-sgRNA。利用CRISPR/Cas9体外酶切含靶点的DNA片段,根据酶切条带的灰度换算成sgRNA活性。结果显示目的sgRNA寡核苷酸双链成功插入到质粒中且序列正确,以质粒为模板体外转录SST-sgRNA成功。靶位点经Cas9蛋白酶切后与标准sgRNA1和sgRNA2酶切活性作比较,确定靶点SST-sgRNA-g1、SST-sgRNA-g4和SST-sgRNA-g5活性较高,可为在细胞水平、胚胎水平做基因定点修饰提供依据。

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