科研产出
基于CRISPR/Cas9技术构建猪KLF4基因敲除细胞系及其对细胞活性的影响分析
《中国畜牧兽医 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：【目的】试验旨在利用CRISPR/Cas9技术构建Krüppel样因子4（Krüppel-like factor 4,KLF4）基因敲除的猪小肠上皮细胞，并探究KLF4基因敲除对于细胞活性和细胞周期的影响。【方法】在猪KLF4基因转录本第1外显子区域设计3条sgRNAs（sgRNA1、sgRNA2和sgRNA3）,经退火形成的双链DNA与线性化pGK1.1载体连接，产物转化大肠杆菌Top10感受态细胞进行鉴定，并将重组载体转染至猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）。PCR扩增敲除位点附近序列，并通过测序判断sgRNA敲除效率；利用CruiserTM Enzyme酶切鉴定阳性细胞克隆，通过TA克隆测序鉴定敲除序列；利用Western blotting检测基因敲除细胞中KLF4蛋白表达情况。利用CCK-8和流式细胞术检测KLF4基因敲除后细胞活性和细胞周期的变化。【结果】重组载体测序结果显示，sgRNAs与pGK1.1成功连接。分析敲除效率发现，3个sgRNAs均可对靶序列进行敲除，其中sgRNA3有较高的敲除效率。PCR产物经CruiserTM Enzyme酶切筛选出2个阳性单克隆细胞。TA克隆测序分析发现，KLF4基因2个等位基因序列分别缺失116和137 bp。Western blotting结果表明，KLF4基因敲除细胞中未见KLF4蛋白表达。细胞活性及细胞周期分析显示，敲除KLF4基因极显著抑制了细胞活性（P＜0.01）,并导致G0/S细胞周期阻滞。【结论】本研究利用CRISPR/Cas9技术构建了KLF4基因敲除的IPEC-J2细胞，且KLF4基因敲除可抑制细胞活性，并引起G0/S细胞周期阻滞。KLF4基因敲除细胞可为进一步探究KLF4基因功能及分子机制提供材料。
关键词： 猪 KLF4基因 CRISPR/Cas9技术 细胞活性 细胞周期
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莲藕腐败病导致藕节组织结构变异的显微观察研究
《植物病理学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：莲藕是我国栽培面积最大、最重要的水生蔬菜。随着种植规模的扩大及栽培制度和栽培方式的单一化，莲藕病害问题日趋严重，其中莲藕腐败病危害最大也最难防治。目前国内外对镰刀菌引起莲藕腐败病致病机理方面的研究较少，本研究基于莲藕地下茎的发病症状，从微观和超显微层面揭示病害发生后地下茎及其维管束组织的变化。石蜡组织切片观察表明，随着病程的发展，发病组织会出现越来越多的被甲苯胺蓝染成深色的坏死细胞，而且这些细胞围绕维管束出现，越靠近维管束其数量越多，分布越密集。为了进一步揭示病原菌侵染对维管束的影响，本研究又利用光学显微镜和扫描电子显微镜对病藕藕丝进行观察，结果表明，随着病变程度加深，藕丝表面原本光滑紧凑的结构变得粗糙松散，且表面附着大量瘤状凸起物以及其它可能的代谢附着物。这些变化势必影响维管束内水分和养分的疏导，最终造成植株地上部分表现失水萎蔫的症状。本研究结果揭示了病害症状发生的细胞生物学机制，并为今后抗性品种的选育提供理论依据。
关键词： 莲藕腐败病 镰刀菌 致病机理 组织学 扫描电子显微镜 莲藕丝
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低氮处理对玉米早期发育胚乳中氨基酸水平和转录组的影响
《植物遗传资源学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：氮素是影响玉米生长发育、产量和籽粒品质形成所必需的营养元素。为挖掘早期发育的玉米胚乳响应低氮胁迫的关键基因，揭示玉米胚乳抵御低氮胁迫的生理响应及分子机制，本研究在低氮和足氮处理下，对授粉后第6天的自交系B73玉米胚乳进行氨基酸含量、氨基酸衍生物含量分析和转录组测序。生理测定表明，低氮胁迫下，玉米胚乳中10种氨基酸或氨基酸衍生物含量升高，其中苏氨酸、β-氨基异丁酸、组氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸含量升高程度最大，其升高范围介于71.1%～153.1%；而其余21种氨基酸或氨基酸衍生物含量降低，其中鸟氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、α-氨基丁酸含量下降程度最大，其下降程度范围介于51.6%～65.8%。转录组测序结果表明，与足氮处理相比，低氮胁迫下玉米胚乳中鉴定到3185个显著上调和2612个显著下调的差异表达基因。进一步检测到参与氮代谢途径和氰基氨基酸代谢途径的差异表达基因分别为12和9个，AP2/ERF-ERF、b ZIP、WRKY差异表达转录因子家族成员分别为20、10和21个。这些候选基因可能是玉米胚乳抵御低氮胁迫响应的重要基因资源，其为玉米胚乳应答低氮胁迫的分子机制及耐低氮玉米新品种培育奠定基础。
关键词： 玉米 低氮胁迫 氨基酸及其氨基酸衍生物 转录组测序 氮代谢 氰基氨基酸代谢 转录因子
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半固体培养法制备非洲猪瘟病毒pA104R蛋白的单克隆抗体
《江苏农业学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：为了快速、高效制备非洲猪瘟病毒（ASFV）单克隆抗体，本研究通过大肠杆菌系统表达并纯化了ASFV重组蛋白pA104R。以ASFV重组蛋白pA104R为抗原，分别比较了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂和常规弗氏佐剂两种免疫策略，并重点比较半固体培养法和常规有限稀释法来制备ASFV pA104R单克隆抗体的效率。结果显示，本研究获得了相对分子质量为3.5×10~4的ASFV重组可溶性蛋白pA104R,通过其与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫小鼠，在第21 d即可达到融合要求，本试验方法（重组蛋白pA104R与CpG ODN联合氢氧化铝佐剂免疫）较重组蛋白pA104R与常规弗氏佐剂免疫节省14 d时间。通过半固体培养法筛选单克隆的试验周期比有限稀释法缩短28 d,并减少了亚克隆的工作量。半固体培养法获得5株阳性杂交瘤细胞，挑选效价较高的3株（9A4、9H6、11F5）进行鉴定，重链均为IgG,轻链均为KAPPA。纯化后的3株单克隆抗体针对pA104蛋白和全病毒蛋白质的效价分别达1∶160 000～1∶320 000和1∶200～1∶400。本研究优选了CpG ODN联合氢氧化铝佐剂结合半固体培养法筛选pA104R的单克隆抗体，为单克隆抗体制备提供了快速高效的新策略。
关键词： 非洲猪瘟病毒 pA104蛋白 单克隆抗体 半固体培养法
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优异常规粳稻亲本组合选配方法及其育种应用
《西南农业学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：[目的]在了解表型与基因型差异的基础上同时对候选常规粳稻亲本进行分类,随后结合育种亲本选配四大原则进行优异亲本选配,为常规粳稻育种提供一种亲本组合选配方法.[方法]以江苏省自主选育水稻品种为材料,考察34个品种的42个表型性状,并利用41对SSR标记对以上34个品种进行基因型鉴定.通过表型值与基因型值分别计算欧几里得距离、遗传相似系数,采用Ward.D法、UPGMA法进行聚类分析.[结果]农艺性状、品质性状的遗传相似性分析表明,大部分试验品种的遗传基础背景比较相近,但SSR标记的遗传相似性分析显示34个品种的遗传相似系数在0.39~0.95,表明江苏不同单位育成的品种遗传背景仍存在不同.聚类分析结果表明,不同类群间农艺性状、品质、等位基因差异与不同生态型不存在明显关系.AMOVA分析显示试验品种96.19%的遗传变异来源于群体内.[结论]不同聚类结果得到的类群不完全一致,将农艺性状、品质性状、SSR标记的聚类结果结合起来对亲本进行分类更有利于增加亲本选配的精确度、减少育种工作量、提高育种效率.本研究应用多种指标聚类方法进行常规粳稻亲本选配,在镇稻18号与盐稻11号组合中,选育出大量优异中间材料,并育成了不同生态型新品种镇稻23号、镇稻32号和镇稻33号.
关键词： 常规粳稻 亲本组合选配 遗传相似性分析 聚类分析 AMOVA分析
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药剂拌种对沿淮地区迟播小麦壮苗效应及产量的影响
《中国农学通报 》 2024 CSCD
摘要：播期延迟易使小麦产量下降,为了探讨药剂拌种对迟播小麦的壮苗效应及产量的影响,以'淮麦40'为试验材料,设置4组不同药剂拌种处理,调查分析了小麦生长素质、籽粒产量等方面的数据.结果表明:通过药剂拌种能提高小麦成苗率;降低麦苗高度,增加叶龄,促进根系生长及生物量积累;可以促进分蘖,增加有效穗数,提高大穗比例,具有增产效应.其中药剂Y3表现最优,与对照处理比较,成苗率提高了 2.1个百分点,在越冬前使小麦株高降低11.9%,叶龄增加16.4%,茎基部宽度增加58.2%,地上部及根系干重分别增加35.8%和45.9%;分蘖能力显著增强,有效穗数增加12.4%,穗粒数及千粒重得到提高,产量增加19.4%.综上表明,在小麦迟播情况下,使用药剂Y3拌种可以增强小麦生长素质,实现稳产增产.
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基于RGB模型的草莓叶片光合作用指标估测
《江苏农业学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：为了研究基于图像红（R）、绿（G）、蓝（B）颜色参数和叶片SPAD值预测光合作用指标的可行性，以草莓叶片为试验材料，构建多元线性回归模型和反向传播（BP）神经网络模型，对叶片蒸腾速率、气孔导度、净光合速率、胞间CO2浓度进行估测，并对其精度进行评价和验证。结果表明，基于BP神经网络模型，使用图像RGB颜色参数和SPAD值对叶片蒸腾速率进行预测的效果较好，其次是气孔导度。BP神经网络模型的估测精度高于多元线性回归模型，蒸腾速率、气孔导度、净光合速率和胞间CO2浓度的模型预测准确率分别达到91.5%、83.3%、74.4%和71.5%。BP神经网络的蒸腾速率模型、气孔导度模型的决定系数（R~2）分别为0.922 2、0.842 3,均方根误差（RMSE）分别为0.000 2、0.025 9,平均绝对误差（MAE）分别为0.000 1、0.000 6。由结果可知，通过数码相机采集图像，并构建RGB模型，可简易快速估测草莓叶片蒸腾速率、气孔导度，能用于生产中草莓光合指标的估测。
关键词： 草莓叶片 RGB模型 光合指标 反向传播（BP）神经网络模型
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小肽Ospep5对水稻耐镉性的影响
《作物学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：镉(Cd)胁迫是植物面临的主要重金属胁迫之一,对植物的生长和发育产生严重的影响.尽管已有研究表明植物小肽具有缓解胁迫的作用,但水稻中镉毒害的研究很少.在前期研究中,通过翻译组、转录组和蛋白质组鉴定了一系列水稻小肽,其中发现Ospep5 可以显著地提高水稻的耐盐性.本研究以日本晴野生型、日本晴过表达Ospep5-OX和日本晴 CRISPR/Cas9 突变体 ospep5-3 作为水稻试验材料,研究 Ospep5 对镉胁迫下水稻幼苗生长的影响.试验结果表明:500 μmol L-1 CdCl2 处理显著抑制了水稻幼苗的形态生长和叶绿素含量,同时超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸(Pro)含量、丙二醛(MDA)含量和镉离子含量显著提高.与单独的镉胁迫相比,外源施加Ospep5 后,可以有效缓解镉胁迫对水稻幼苗的形态生长的抑制,显著提高超氧化物歧化酶(SOD)活力,同时显著降低丙二醛(MDA)含量、脯氨酸(Pro)含量和镉离子含量,并且能够促进耐镉基因(OsHMA2、OsHMA3、OsCAL1)的表达.总之,Ospep5 通过调节水稻幼苗各种生理生化反应以及调控耐镉基因表达的方式,最终提高水稻幼苗对镉胁迫的耐受性.
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30个杨梅品种果实品质分析与综合评价
《果树学报 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：[目的]评价不同杨梅品种果实品质的差异,建立杨梅果实品质综合评价体系.[方法]以30个杨梅品种为试验材料,对果实外观品质、内在品质和矿质元素指标进行测定和分析,并利用主成分分析法对30个杨梅品种果实品质进行综合评价.[结果]30个不同杨梅品种的果实各个品质指标之间存在较大差异,部分内在品质指标和矿质元素指标存在显著差异.综合相关性分析和主成分分析筛选出可溶性固形物(TSS)、可滴定酸、抗坏血酸(AsA)、苹果酸、总酚和硒(Se)矿质元素含量作为杨梅果实品质性状评价的核心指标.[结论]采用相关性分析和主成分分析综合评价方法可为优良杨梅品种筛选提供参考依据.
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猪肺炎支原体通过抑制SPLUNC1功能破坏呼吸道炎性反应平衡
《中国农业科学 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：【背景】猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp）通过定植猪呼吸道黏膜层，破坏呼吸道炎性反应平衡，引起炎性损伤和持续性感染。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆1蛋白（short palate lung and nasal epithelial clone1,SPLUNC1）是呼吸道黏膜分泌的具有重要抗菌和抗炎功能的蛋白，被认为是呼吸道黏膜面对危险信号时的“信号传感器”。【目的】从Mhp和SPLUNC1相互作用入手，分析Mhp感染对SPLUNC1表达的影响以及SPLUNC1对Mhp引起的炎性反应的调控作用，揭示Mhp引起炎性损伤的新机制，为解决Mhp持续性感染问题提供参考。【方法】利用猪肺炎支原体对猪支气管上皮细胞（porcine bronchial epithelial cells,PBECs）感染模型和猪体感染模型，通过荧光定量PCR、间接免疫荧光和Western-blotting等方法，分别检测Mhp感染后对肺脏中SPLUNC1以及体外PBECs中SPLUNC1转录和表达的影响。克隆并扩增猪源SPLUNC1基因通过酶切鉴定，构建成功SPLUNC1真核和原核表达重组质粒pCDNA3.1-SPLUNC1以及pET28a-SPLUNC1。与此同时，设计靶向SPLUNC1的siRNA干扰片段。利用体外SPLUNC1蛋白孵育、体内呼吸道黏膜SPLUNC1抗体封闭，通过Mhp CCU50检测明确SPLUNC1对Mhp体内外生长的影响。在猪支气管上皮细胞中，通过过表达或siRNA干扰SPLUNC1基因，后感染Mhp，利用Western-blotting、间接免疫荧光以及酶联免疫吸附方法，明确SPLUNC1对Mhp的黏附作用、诱导炎性因子表达以及MAPK信号通路活化的影响。【结果】Mhp感染猪后可引起肺脏实变，主要组织病理表现为肺脏炎性损伤，同时显著上调肺泡灌洗液中趋化因子CXCL8和炎性因子TNFα和IL-1β分泌。Mhp体内外感染后，体内肺脏和体外猪支气管上皮细胞中SPLUNC1的转录和表达均显著下调。以上研究表明，Mhp可诱导肺脏炎性反应，抑制SPLUNC1表达。另一方面，体外PBECs中过表达SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著减少；siRNA干扰SPLUNC1后，Mhp感染引起的CXCL8表达显著增加，表明SPLUNC1负调控Mhp感染引起的CXCL8表达。基于Mhp感染入侵呼吸道过程，本研究进一步解析SPLUNC1负调控CXCL8表达的机制。结果表明：无论是SPLUNC1和Mhp体外孵育，还是SPLUNC1抗体体内封闭，Mhp的体内外生长均未受影响；SPLUNC1的过表达或siRNA干扰对Mhp体外黏附PBECs的能力也无显著影响；过表达SPLUNC1可抑制pERK和IκBα的激活，相反SPLUNC1 siRNA干扰后，可促进pERK和IκBα的激活。以上研究证明SPLUNC1不是通过调控Mhp的生长和黏附，而是通过负调控MAPK-ERK通路的活化来调控CXCL8的表达。【结论】SPLUNC1可通过MAPK-ERK信号通路来调控炎性因子的过度表达，维护宿主炎性平衡；与此同时，Mhp感染后可通过抑制SPLUNC1的表达来破坏宿主炎性反应的平衡调控，进而引起炎性损伤。本研究为解析Mhp感染损伤机制提供依据。
关键词： 猪肺炎支原体 支原体-宿主相互作用 炎性反应 SPLUNC1
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