宿主细胞转录因子E2相关因子2对EIAV复制影响的初步研究

文献类型： 中文期刊

第一作者： 马官芹

作者： 马官芹;王岩;林跃智;王晓钧

作者机构：

关键词： Nrf2;CRISPR/Cas9;敲除细胞系;马传染性贫血病毒

期刊名称： 中国预防兽医学报

ISSN： 1008-0589

年卷期： 2022 年 002 期

页码： 119-125

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 转录因子E2相关因子2（Nrf2）是细胞重要的调节抗氧化应激的转录因子，其活性状态与病毒感染引起的炎症及免疫清除相关。为研究Nrf2对马传染性贫血病毒（EIAV）复制的影响，本研究通过CRISPR在线设计工具，靶向于Nrf2设计2条特异性sgRNAs，经程序性退火后连接到LentiCRISPRv2-GFP载体中构建重组质粒并分别经测序鉴定正确后，转染HEK293T细胞，24 h后通过western blot筛选沉默Nrf2基因效率最高的sgRNA，结果显示，2条sgRNAs均具有较高的沉默效率。将重组质粒LentiCRISPRv2-GFP-sgRNA-N1转染HEK293T细胞，利用流式细胞仪筛选表达GFP的单细胞克隆，并扩大培养后，经western blot和测序鉴定，筛选到2株不表达Nrf2的细胞，这2株细胞基因组均缺失一个碱基T，导致Nrf2基因发生移码突变而无法表达。选择其中一株细胞，将该细胞连续传代，选择第10代（G10）、15代（G15）、20代（G20）细胞经western blot鉴定其遗传稳定性，结果显示各代次细胞均未检测到Nrf2基因的表达，表明该敲除细胞系可稳定遗传，将其命名为HEK293T-Nrf2KO细胞。将EIAV感染性克隆CMV3-8及Nrf2基因回补的感染性克隆CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2分别转染HEK293T-Nrf2KO细胞，24 h后收获细胞和上清，通过western blot分别检测细胞和上清中的病毒蛋白Gag及利用反转录酶活性试验（RT）检测上清中病毒的复制。western blot结果显示，与CMV3-8转染的HEK293T细胞相比，转染CMV3-8的HEK293T-Nrf2KO细胞和上清中病毒蛋白Gag表达均上调约1.5倍，而转染CMV3-8+pVR1012-flag-Nrf2HEK293T-Nrf2KO细胞和上清中的病毒蛋白Gag表达下调约50%;RT的检测结果与western blot的检测结果一致。结果表明Nrf2基因可以抑制EIAV在HEK293T细胞中的表达。通过将相关质粒转染HEK293T细胞包装EIAV假病毒，并将其分别感染HEK293T和HEK293T-Nrf2KO细胞24 h后，分别检测病毒的荧光素酶信号，结果显示，与对照组相比，感染假病毒的细胞病毒复制能力显著增强。进一步表明，敲除Nrf2基因有助于病毒对细胞的感染。以上结果表明，Nrf2能够抑制EIAV在HEK293T细胞中的复制。本研究利用CRISPR/Cas9技术构建的敲除Nrf2基因的HEK293T细胞系，可以用于研究宿主Nrf2对EIAV复制的影响，本研究首次证实了宿主Nrf2可以抑制EIAV的复制。本研究构建的HEK293T-Nrf2KO细胞系为宿主Nrf2调控EIAV复制机制的研究提供了有效工具。

分类号： S852.65

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