NADC30-like猪繁殖与呼吸综合征病毒样颗粒的制备与鉴定

文献类型： 中文期刊

第一作者： 陶一墨

作者： 陶一墨;解长占;王鹏;金宁一;鲁会军

作者机构：

关键词： NADC30-like猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV）;病毒样颗粒;重组杆状病毒

期刊名称： 微生物学通报

ISSN： 0253-2654

年卷期： 2022 年 012 期

页码： 5287-5297

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【背景】猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）可以造成怀孕母猪的繁殖障碍及仔猪的呼吸系统疾病，近年来，NADC30-like谱系PRRSV已成为国内的优势流行毒株。【目的】研制针对NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒（virus-like particle,VLP）疫苗。【方法】将PRRSV NADC30-like毒株编码GP5蛋白开放阅读框5 （open reading frame 5,ORF5）、ORF6 （编码M蛋白）分别连接至pFastBacTMDual载体P10和PH启动子下游多克隆位点，获得穿梭质粒pFB-30-ORF5及pFB-30-ORF6，酶切鉴定后，将ORF6基因插入到穿梭质粒pFB-30-ORF5 PH启动子下游，构建穿梭质粒pFB-30-ORF5-OPF6。将上述3种穿梭质粒分别转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞，通过蓝白斑筛选及PCR鉴定重组杆粒。再将获得的重组杆粒转染至SF9昆虫细胞，发现细胞病变后收获病毒液，继续盲传3代，在透射电镜下观察是否有病毒样颗粒。用第3代病毒液感染SF9细胞后，分别用GP5蛋白、His-tag、Flag-tag单克隆抗体作为一抗，通过免疫电镜、间接免疫荧光（indirectimmunofluorescenceassay,IFA）、Western blotting鉴定重组蛋白。【结果】成功构建了3种穿梭质粒pFB-30-ORF5、pFB-30-ORF6和pFB-30-ORF5-OPF6，酶切鉴定正确。通过蓝白斑筛选及PCR验证后获得重组杆粒，分别命名为Bacmind-30-ORF5、Bacmind-30-ORF6和Bacmind-30-ORF5-ORF6。重组杆粒感染SF9细胞120h时出现明显的细胞病变，收获病毒液后，在透射电子显微镜可观察到大小为50nm左右呈现球形结构的VLPs。免疫电镜可以观察到胶体金颗粒结合在VLPs周围；IFA结果显示实验组均出现了明显绿色的特异性荧光灶；Western blotting结果表明，3种VLPs均出现特异性条带，并与预期大小一致。【结论】制备了3种NADC30-like谱系PRRSV的病毒样颗粒，为针对PRRSV新谱系流行株疫苗的研发奠定了基础。

分类号： S852.651

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