猪神经介素B受体基因慢病毒过表达载体的构建与鉴定

文献类型： 中文期刊

第一作者： 邵淑玉

作者： 邵淑玉;李佳;马卓;于畅;张莹;张金龙;马志禹

作者机构：

关键词： 神经介素B受体（NMBR）;慢病毒;过表达;Leydig细胞

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2022 年 010 期

页码： 3756-3763

收录情况： 北大核心

摘要： 【目的】构建猪神经介素B受体（NMBR）基因慢病毒过表达载体，并检测其在猪Leydig细胞中的表达，为研究NMBR基因过表达在猪睾丸间质（Leydig）细胞中的功能提供参考。【方法】根据猪NMBR基因（GenBank登录号：KM058699）CDS序列设计并合成特异性酶切引物，通过RT-PCR扩增获得猪NMBR CDS全长序列，构建pMD19-T-NMBR质粒；通过XbaⅠ和EcoRⅠ对pCD513B-1和pMD19-T-NMBR质粒双酶切，构建pCD513B-1-NMBR重组质粒；将pCD513B-1-NMBR重组质粒与辅助质粒共转染人胚肾细胞（HEK-293T）,转染48 h后通过荧光倒置显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白（GFP）情况，收集细胞培养液上清获得猪NMBR基因过表达慢病毒，并通过倍比稀释法测病毒效价；然后将猪NMBR基因过表达慢病毒转染猪Leydig细胞，转染48 h后观察细胞中GFP表达，收集细胞并通过实时荧光定量PCR检测NMBR mRNA的表达情况。【结果】通过RT-PCR成功扩增获得猪NMBR CDS全长序列，大小为1 173 bp; pMD19-T-NMBR重组质粒双酶切为2条特异性条带，条带大小分别与pMD19-T质粒和猪NMBR CDS序列片段大小一致，表明成功构建pMD19-T-NMBR质粒；通过双酶切获得线性化的pCD513B-1和NMBR序列；RT-PCR和测序结果表明，成功构建慢病毒过表达载体pCD513B-1-NMBR;pCD513B-1-NMBR转染48 h后，HEK-293T细胞中呈现大量绿色荧光，表明病毒包装成功，病毒效价约为4×10~6 TU/mL;NMBR基因慢病毒转染猪Leydig细胞48 h后，80%以上细胞有GFP表达，表明大部分细胞成功转染慢病毒；实时荧光定量PCR检测结果表明，转染慢病毒后能够极显著增加NMBR mRNA的表达（P＜0.01）。【结论】本试验成功构建了猪NMBR基因慢病毒过表达载体，并证实猪NMBR基因过表达慢病毒能够增加猪Leydig细胞NMBR基因的表达，为研究NMBR基因过表达在猪Leydig细胞中的作用奠定基础。

分类号： Q78

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