文献类型： 中文期刊

作者： 吴林 ¹ ; 阳经慧 ² ; 陈明杰 ³ ; 汪虹 ⁴ ; 鲍大鹏 ⁵ ;

作者机构： 1.国家食用菌工程技术研究中心

2.农业部南方食用菌资源利用重点实验室

3.上海市农业遗传育种重点开放实验室

4.上海市农业科学院食用菌研究所

5.西北农林科技大学生命科学学院

关键词： 草菇;漆酶基因;异源表达;漆酶活性

期刊名称： 微生物学报

ISSN： 0001-6209

年卷期： 2014 年 54 卷 07 期

页码： 828-835

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】克隆草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA,证实其编码的蛋白具有漆酶活性,最终建立草菇漆酶基因的异源表达及纯化体系。【方法】利用RACE技术克隆全长cDNA序列,并利用生物信息学技术进行序列分析,在此基础上,去除全长cDNA的编码信号肽的序列并在3'端添加His-tag碱基序列,把修饰后的cDNA片段克隆到表达载体pPIC9K上,并转化到毕赤酵母GS115中进行表达,对重组蛋白利用Ni柱进行分离纯化并以ABTS底物法检测重组蛋白的漆酶活性。【结果】vv-lac1和vv-lac6的全长cDNA的长度分别为1599 bp和1554 bp,且分别含有19和15个外显子;其编码的蛋白的理论分子量分别是57.3 kDa和56.3 kDa,理论等电点分别为4.73和5.62,且都属于分泌型的胞外蛋白;表达出的重组蛋白RBvvlac1和RBvvlac6,其分子量大小约为70 kDa,说明存在翻译后修饰;含有150 mmol/L咪唑的缓冲液对RBvvlac1和RBvvlac6发酵液进行洗脱所得到的蛋白溶液具有最高漆酶活性(333.17 U/L和227.63 U/L)。【结论】草菇漆酶基因vv-lac1和vv-lac6能够编码有活性的漆酶蛋白,本研究建立的异源表达及纯化体系适用于草菇或其它漆酶基因的异源表达与纯化。