文献类型： 中文期刊

作者： 赵为民 ¹ ; 戴超辉 ¹ ; 陈哲 ¹ ; 涂枫 ¹ ; 李辉 ¹ ; 付言峰 ¹ ; 李碧侠 ¹ ; 任守文 ¹ ; 程金花 ¹ ;

作者机构： 1.江苏省农业科学院畜牧研究所;江苏省农业种质资源保护与利用平台;农业农村部种养结合重点实验室

关键词： CRISPR;dCas9-KRAB;LncRNA-NEAT1基因;猪;基因沉默

期刊名称： 江苏农业学报

ISSN： 1000-4440

年卷期： 2023 年 39 卷 004 期

页码： 1036-1042

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 本研究利用RT-PCR检测 LncRNA-NEAT1 基因表达在细胞中的亚定位,采用 5′RACE获得 LncRNA-NEAT1 基因的转录起始位点;利用CRISPOR软件对-300~0 bp区域的LncRNA-NEAT1 启动子序列设计sgRNA并构建到px330 载体,通过转染细胞与T7E1 酶切验证sgRNA效率;利用酶切和亚克隆方法将dCas9-KRAB-BSD片段替换px330 载体的Cas9 序列,形成重组px330-dCas9-KRAB载体;将验证有效的sgRNA构建到px330-dCas9-KRAB载体,形成px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体.添加不同质量浓度的Blasticidin S处理细胞,以最小致死质量浓度来确定筛选质量浓度.转染px330-sgRNA-dCas9-KRAB载体并用Blasticidin S筛选细胞 7d后进行LncRNA-NEAT1 基因的表达检测,同时对sgRNA在LncRNA-NEAT1 基因启动子上的结合位点进行Sanger测序,以进一步验证上述结合位点是否发生切割.结果显示LncRNA-NEAT1 主要表达于细胞核,而在细胞质中几乎不表达.5′RACE获得了Ln-cRNA-NEAT15′端大约 270 bp的序列.qPCR检测结果显示,与对照组相比,sgRNA1 和sgRNA2 能够显著抑制Ln-cRNA-NEAT1 的表达(P<0.05).Sanger测序结果表明sgRNA1 和sgRNA2 所在的位点并没有发生碱基缺失和插入.研究结果为后续进一步研究LncRNA-NEAT1 在先天性免疫反应中的功能奠定了基础.