文献类型： 中文期刊

作者： 唐青海 ¹ ; 刘博 ² ; 谢金文 ² ; 魏凤 ² ; 谷英华 ³ ; 高翠翠 ¹ ; 曹宗喜 ⁴ ; 张艳 ⁴ ; 王文秀 ² ;

作者机构： 1.衡阳师范学院生命科学学院南岳山区生物资源保护与利用湖南省重点实验室

2.山东省滨州畜牧兽医研究院

3.山东绿都生物科技有限公司

4.海南省农业科学院畜牧兽医研究所海南省热带动物繁育与疫病研究重点实验室

关键词： 猪视网膜色素上皮细胞;永生化;猪流行性腹泻病毒;猪圆环病毒2型;猪伪狂犬病毒

期刊名称： 西北农林科技大学学报(自然科学版)

ISSN： 1671-9387

年卷期： 2024 年 52 卷 002 期

页码： 22-31

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]建立永生化猪视网膜色素上皮细胞系,为病毒学研究提供一种新的细胞材料.[方法]合成猪腺病毒3型E1基因,将其克隆至真核表达质粒pCI-neo中,构建E1基因真核表达质粒pCI-neo-E1,进行PCR和测序鉴定.提取pCI-neo-E1质粒,转染原代猪视网膜色素上皮细胞,用新霉素G418筛选猪永生化视网膜色素上皮细胞系(RPECs).检测RPECs的角蛋白18和19,通过细胞计数测定其生长曲线,流式细胞仪检测细胞周期,并对其进行染色体核型分析.分别将猪流行性腹泻病毒(PEDV)CV77毒株、猪圆环病毒2型(PCV2)DBN-SX07株和猪伪狂犬病毒(PRV)Bartha-K61株接种RPECs,同时将PEDV CV77毒株接种绿猴肾细胞(Vero细胞),将PCV2 DBN-SX07株接种猪肾细胞(PK15细胞),将PRV Bartha-K61株接种仓鼠肾成纤维细胞(BHK细胞),观察细胞病变效应(CPE),并采用间接免疫荧光法测定病毒的滴度.[结果]PCR和测序结果显示,真核表达质粒pCI-neo-E1构建成功.将pCI-neo-E1转染原代猪视网膜色素上皮细胞,经G418筛选得到永生化细胞株,该细胞株表达角蛋白18和19,传代50代仍保持上皮样细胞形态,增殖活性良好,细胞周期及染色体核型特征与正常的二倍体细胞一致.PEDV CV77毒株感染猪RPECs 24 h后,CPE明显,滴度为105.25TCID50/mL,低于其在Vero细胞中的滴度(108.125 TCID50/mL).PCV2 DBN-SX07毒株感染猪RPECs后可产生明显CPE,病毒滴度为106.125TCID50/mL,略高于其在PK15细胞上的滴度(106 0TCID50/mL).PRV Bartha-K61 毒株感染猪 RPECs 后,CPE 明显,病毒滴度为 108.75 TCID50/mL,略低于其在BHK上的滴度(108.875 TCID50/mL).[结论]成功构建了永生化猪视网膜细胞系,可用于猪源病毒的培养,尤其是培养PCV2可产生明显CPE,易于观察,为后续开展疫苗工艺的提升提供了一种新的细胞材料.