科研产出
养羊业高新生物技术的应用(下)
《新疆农垦科技 》 2000
摘要：(续第 5期 )2 转基因动物应用转基因动物是指用实验手段 ,将外源基因导入动物生殖细胞 ,由此稳定整合到动物基因组 ,并能遗传给子代的动物。2 .1 转基因动物制作方法 :简单地讲 ,制作转基因动物应包括以下步骤 :目的基因 (基因组基因或c DNA)的克隆 ,表达载体的构建 ;受精卵的收集 ;外源基因的导入 ,胚胎的移植和对出生后代的鉴定、分析、繁殖和选育。其中目的基因的转移是制作转基因动物的关键技术。外源基因导入受精卵大致分三类方法 :即物理方法、化学方法和生物方法。2 .1.1 物理方法 :主要包括显微注射法、电激法、超声波法、冻融法、基因枪法等。其中以显微注射法应用最普遍 ,大多数转基因动物是通过该法获得的。显微注射法的优点是可导入大片段 (≥ 50 kb)的外源基因 ;外源基因的整合率相对较高 ;外源基因几乎分布于所有组织细胞中。其局限性是要求仪器精密 ,造价高 ;在有些动物如猪、山羊等受精卵原核不易看清 ,需作特殊处理才能有效地将外源基因导入。2 .1.2 化学方法 :包括磷酸钙沉淀法、多聚阳离子试剂法、脂质体介导法 DEAE—葡聚糖法等。目前 ,用脂质体介导是最佳的选择。脂质体种类较多 ,多数为阳离子脂质体。首先将磷脂、胆固醇或其它脂类的乙醚溶液与 DNA(目的基因片段 )溶液混合 ,加温蒸发得到单 /双层带有 DNA的脂质体小泡 ;DNA包囊在脂质体膜内 ,可以与细胞融合 ,被细胞内吞 ,从而完成细胞的导入。该法效率很高 ,10 0 %的离体细胞可以瞬时表达外源基因。磷酸钙沉淀法是利用化学反应将外源基因包在形成的沉淀微粒中 ,然后被受体细胞所吞食而导入。此法材料易得 ,方法简便 ,为很多实验室采用。2 .1.3 生物学方法 :主要包括反转录病毒法、精子载体法、原生质介导法、细胞融合法、ES(胚胎干细胞 )法及人工染色体 ( YAC)法。2 .1.3.1 反转录病毒载体可插入各种基因组c DNA,但其容量较小 ,在 10 kb以下。该方法的优点是感染率高 ,宿主范围广 ,整合率高。2 .1.3.2 精子载体法是将精子与 DNA(目的基因 )孵育后使之吸附在精质膜上 ,也有 DNA进入精子头部质膜内侧 ;然后通过受精将外源基因导入。此法特异性强 ,操作简便。尽管在学术界对精子载体法尚存争议 ,但用该方法已成功获得转基因动物 (鱼、鸡、羊等 )。2 .1.3.3 ES细胞法是将外源基因直接导入 ES细胞 (胚胎干细胞 ) ,经体外培养筛选后 ,注入表胚 ,再移植入受体子宫内 ,发育为嵌合体转基因动物。该方法可在细胞移植前对其进行鉴定和筛选 ,有利于培养转基因动物纯合系 ;但 ES细胞的分离合培养并不容易 ,目前仅在少数动物 (小鼠、猪等 )的 ES细胞培养成功 ,故该方法的应用尚有待于发展和完善。2 .1.3.4 人工染色体 ( YAC)法对于超过 10 0 kb的外源基因就需要人工染色体 ( YAC)作为载体 ,这种载体携带外源基因容量大 ,高达 50 0～ 60 0 kb,可满足几乎所有单个基因组基因的需要。存在于 YAC中的外源基因可不整合到细胞基因组中 ,从理论上可以在细胞中稳定存在 ;但 YAC如何不被宿主细胞所丢失以及细胞分裂时携带有外源基因的 YAC如何正确分配等 ,尚需在理论和实践中进行进一步研究和探讨。2 .2 转基因动物的鉴定确认 :对转基因动物的鉴定通常采用的是不同层次的分子生物学检测法 ,如基因水平的 DNA印迹法 ( Southern blot)、转录水平的RNA印迹法 ( Northern blot)、翻译水平的蛋白印迹法 ( Western blot) ,也可采用基因定位法 ( Genelocation)。充分的分子生物学证据是确认转基因动物的最后依据。1996年由国家“863”办公室主持召开了“转基因动、植物学术讨论会”,会上确定了转基因动、植物的标准。这些标准包括 :要有严格的对照和应具有目的基因控制的表现性状 ,以及所携带的外源基因能稳定遗传后代。2 .3 转基因动物研究的应用2 .3.1 利用转基因技术进行动物新品种培育和提高生产性能 :利用转基因技术改变动物的遗传性状 ,使其按照人们所希望的方向转变。如提高生长速度 ,增加畜产品产量 ,改进畜产品质量等。继 Palmiter将大鼠生长激素 ( GH)基因导入小鼠基因组得到巨型鼠后 ,人们用不同 GH基因对不同动物进行了转基因研究 ,发现整合有外源 GH基因动物的生长速度都有不同程度的提高。Rexroad等 ( 1989年 )应用GH基因获得转基因羊 ,其瘦肉率相当高 ,而饲料利用率和生长速度则与对照组无显著差异。已知胱氨酸不足是动物毛发生的限速氨基酸 ,因而是制约产毛量的关键性氨基酸。反刍动物瘤胃微生物能够分解胱氨酸 ,故在日粮中添加胱氨酸并不能奏效。在澳大利亚的两个实验室 ,分别将细菌中能将硫固定并转化为胱氨酸的胱氨酸合成酶基因克隆出来 ,并用于转基因动物研究。 Roger( 1990年 )、Word( 1991年 )、Nancarrow( 1993年 )等分别将由大肠杆菌和沙门氏菌中分离到的丝氨酸乙酰转移酶基因和 0—乙酰丝氨酸硫化氢解酶基因 ,并经基因转移获得了转基因绵羊。体内胱氨酸合成能否增强 ,尚需进一步研究。Bullock D.W.( 1995年 )报道 ,经转基因获得的转类胰岛素生长因子— I( IGF— 1)的转基因羊的产毛量得到了提高。2 .3.2 利用转基因动物制造具有生物活性的产品 :利用某些有药物功能的蛋白基因制作转基因动物 ,使其表达这种功能蛋白 ,实际上这种转基因动物是作为“生物反应器”来生产药用蛋白。例如 :可从转基因动物的血浆或乳汁中分离某些重组蛋白 ,而不需杀死动物。英国的罗斯林研究所获得 α1—抗胰蛋白酶的转基因羊 ,乳汁中 α1-抗胰蛋白酶可用于治疗遗传性肺气肿。我国上海曾溢滔教授等于 1997年 2月宣布 ,已获得 5只带有人凝血因子基因整合的转基因山羊 ,其中 1头已进入泌乳期 ,乳汁中有凝血因子 IX蛋白的特异表达 ,并用于血友病的基因治疗。用转基因羊生产红细胞生长因子 ( EPO)也获成功。利用“生物反应器”生产功能性蛋白的前景是十分乐观的。2 .4 转基因动物实用化的问题与展望2 .4 .1 目前转基因动物研究存在理论基础积累不足和技术不完善等问题 ,使得重组基因在受体动物基因组上存在随机整合 ,调节失控 ,遗传不稳定以至于表达效率不高等问题 ,急需从理论上突破 ,并获得更多的构件合理的 ,有使用价值的结构基因。2 .4 .2 转基因动物技术方法研究仍需深入 ,目前虽有多种制作转基因动物的技术方法 ,但最为广泛采用、效果相对明显的是显微注射法。但显微注射外源基因整合效率较低 ,所以该法仍急待改进和提高。2 .4 .3 动物的生物学特性也影响着转基因动物的实用化。所选择的动物要世代间隔短、窝产数多、维持成本低、专一性表达的组织容量和抗病毒感染能力强的。首选的动物应该是猪和羊等家畜。2 .4 .4 根据目前转基因动物研究的结果、重要性、可能性和开发前景 ,转基因动物生物反应器和器官移植将会在实用化方面取得突破性进展。也应选为我国在此方面的研究重点和突破口。3 克隆胚胎技术应用使家畜多产胚胎的途径有二 :一是发挥卵巢的作用 ,目前常用的方法是超数排卵处理和卵巢卵母细胞的体外成熟、体外受精和体外培养形成胚胎 ;二是用胚胎产生胚胎 ,即克隆胚胎技术。 2 0世纪 70年代 ,由于哺乳类卵子的体外培养、体外受精和胚胎移植技术的发展 ,特别是显微操作技术的出现 ,使哺乳类胚胎多代克隆 (重复克隆 )研究取得重大突破。3.1 克隆胚胎技术 :目前克隆胚胎技术的应用研究有以下三个方面 :3.1.1 胚胎分割 :该技术已应用多年 ,本文不再赘述。3.1.2 卵裂球分离培养 :卵裂球分离指将早期胚胎用化学或机械方法分离为单个的卵裂球 ,将每一枚卵裂球进行体外培养发育至胚胎后 ,进行胚胎移植并发育为成体动物的过程。卵裂球分离实际上是胚胎分割的一种形式。由于卵裂球在不同卵裂阶段数目不同 ,在用卵裂球进行分离培养时 ,既可取多个 ,也可以只取一个。 Willsdsen( 1979年 )、Willadsen( 1981年 )取 2 -、4 -、8-细胞期的羊单个卵裂球都具有正常的发育能力。 Willadsen报道用洋菜胶( agar)包埋透明带受损的绵羊胚 ,以帮助绵羊卵裂球在输卵管内发育至囊胚期。将洋菜胶去除后进行胚胎移植 ,得到同卵多胞后代。 Menedith等 ( 1990年 )直接以海藻酸钙胶囊分别包埋桑椹胚绵羊胚和山羊胚 ,能使包埋的胚胎顺利发育成幼羔。通过卵裂球分离培养而进行胚胎克隆已被广泛进行研究 ,与另外两种胚胎克隆的方法即胚胎分割和核移植相比 ,它更具有操作简单 ,并在遗传上具完全一致的优势和特点。3.1.3 核移植技术进行胚胎的多代克隆 :Willadsen( 1986年 )利用绵羊胚胎细胞核移植获得产羔 ,其实验阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个重要问题 :( 1)卵母细胞作为核受体比受精卵有更大的优越性 ;( 2 )羊桑椹胚细胞核具有发育全能性。随后在牛、兔、猪和山羊等动物也获得成功。羊胚胎多代克隆的目的是通过重复细胞核移植生产大量的胚胎和羔羊。现已建立了一些重要的方法。例如 :采用体外成熟的卵母细胞为胞质受体 ;第二次减数分裂末期去核的先进技术 ;采用体外成熟、体外受精和体外培养形成的胚胎以及经冷冻保存的胚胎卵裂球为核供体 ;核移植胚 (重构胚 )体外培养可发育至囊胚期 ;克隆胚胎可以冷冻长期保存等。迄今对多代克隆研究尚少。我国已报道山羊胚胎的多代克隆 (成勇等 ,1995年 ) ,利用山羊胚胎克隆后的重构胚在体外培养 ,选择其中发育正常的 6～ 18细胞的克隆胚 ,再克隆。将 12 9枚克隆胚和 143枚再克隆胚移植后 ,获得克隆羊 2只和再克隆羊 4只。国外有关牛胚胎多代克隆研究已有数篇报道。已连续克隆 6代获得囊胚期胚胎 ,移入受体母牛产生了 1～ 3代的克隆牛。从 1枚牛胚胎通过 3代克隆获 4 3枚胚胎 ,通过 4代克隆获 54枚胚胎。预计在不久的将来可通过多代细胞核移植来实现动物胚胎克隆的商业化生产。3.2 胚胎多代克隆的应用前景及存在问题3.2 .1 应用前景 :多代克隆 ( Multiple generationalcloning或 Recloning)可将核移植胚胎的卵裂球作为供体 ,进行第二代以至重复多代核移植 ,产生多代克隆胚胎和克隆动物。如果重复每一代的成功率能稳定 ,便可持续生产大量克隆胚胎。可快速大量扩增遗传性状优良的动物 ,加速遗传改良和育种进程。还可促进珍奇、濒危动物的种群扩大。另外与转基因技术结合起来 ,可生产克隆的转基因动物。最近 ,英国PPL公司的科学家宣布 ,他们首次克隆出基因经过选择性修改的克隆羊。这一突破有助于培育出对许多疾病具有免疫能力的动物 ,并将对人类医学研究产生重大影响。3.2 .2 实用化中存在的问题3.2 .2 .1 克隆代数是否有限制 :迄今已重复细胞核移植 6次 ,产生了第 6代的克隆囊胚。克隆了第 1～2代的克隆羊和第 1～ 3代克隆牛。现在待研究解决的是 :1枚亲本胚胎能重复克隆无限进行吗 ?能产生多少可移植胚胎 ?至多少代的胚胎移植至受体后还能产生克隆成体动物 ?根据生产开发的效率 ,应以克隆多少代为宜 ?解决了这些问题之后才能制订出多代克隆技术开发的标准程序。3.2 .2 .2 筛选实用于克隆的亲本胚胎 :在多代克隆中发现 ,用于克隆的供体胚胎 ,经多代克隆后所产生克隆胚胎的数量差异很大 ,多者通过 3代克隆产生了 4 3枚克隆胚胎 ,少者仅 14枚。故应研究并建立筛选克隆潜力大的亲本胚胎的方法 ,以提高多代克隆效率。3.2 .2 .3 研究无限提供细胞核供体的途径 :以良种羊的囊胚建立胚胎干细胞系 ( ES) ,以此具全能性的细胞作核供体进行多代克隆。如果成功 ,将是长期无限提供核供体进行多代克隆的途径。首先要研究是否可用羊 ES进行细胞核移植产生克隆胚和克隆羊。3.2 .2 .4 提高核移植重构胚的发育率 ,克隆胚的发育率显著低于体外受精胚。导致克隆胚的发育率低的原因可能是 :( 1)重复显微操作 ;( 2 )细胞骨架抑制剂 ;( 3)去核时移出多量细胞质 ;( 4 )细胞核染色和柴外光照射 ;( 5)电刺激 ;( 6)可能产生染色体异常等。要找出主因 ,加以改进 ,提高克隆胚的发育率。3.2 .2 .5 提高胚胎冷冻保存效果建立卵母细胞冷冻保存方法 :研究结果表明 ,冷冻长期保存供体胚胎和克隆胚胎的方法已建立并基本成熟 ,今后要进一步研究提高冷冻—解冻胚胎的存活率。另一个要研究的重点是建立冷冻保存卵母细胞 (包括去核前和去核后的卵母细胞 )的方法 ,以便随时提供多代克隆所需的受体卵母细胞。 (完 )养羊业高新生物技术的应用(下)@刘守仁$新疆农垦科学院!石河子市832000 @王新华$新疆农垦科学院!石河子市832000
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干旱地区营养袋法培育樟子松苗关键技术
《林业科技通讯 》 2000 北大核心
摘要：通过对不同装袋时间、不同装袋苗龄和不同营养袋规格的试验 ,总结出干旱地区樟子松营养袋法培育大苗的关键技术
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