文献类型： 中文期刊

作者： 王晶晶 ¹ ; 张新笑 ¹ ; 卞欢 ¹ ; 耿志明 ¹ ; 李鹏鹏 ¹ ; 王道营 ¹ ; 徐为民 ¹ ;

作者机构： 1.江苏省农业科学院农产品加工研究所

关键词： 麻鸭;磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(GPx4);原核表达;纯化;酶学性质

期刊名称： 南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2019 年 50 卷 005 期

页码： 1120-1126

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]克隆麻鸭磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶基因(GPx4)并在大肠杆菌中表达,分析其酶学特性,为研究GPx4功能及其在羟基脂肪酸形成过程中的调节机制打下基础.[方法]采用RT-PCR克隆麻鸭GPx4(DGPx4)的编码基因,利用定点突变的方法构建半胱氨酸突变体DGPx4表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys),并在大肠杆菌中通过添加His标签进行可溶性表达,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析纯化得到融合蛋白DGPx4;采用总谷胱甘肽过氧化物酶活性检测试剂盒检测DGPx4活力以研究其酶学性质.[结果]克隆获得的DGPx4基因编码序列全长516 bp,编码172个氨基酸,编码蛋白分子量约20 kD,理论等电点(pI)为8.9.构建的突变体基因原核表达载体pMBP-DGPx4(48Sec→Cys)可在大肠杆菌中成功诱导表达获得融合蛋白DGPx4,经Ni-NTA亲和层析和离子交换层析即获得高纯度的DG-Px4.以烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)为底物时,DGPx4的最适反应温度为32℃,最适pH为8.0,对NaCl浓度较敏感;Cu2+和Ni2+对DGPx4活力有较高的促进作用,Mg2+和Mn2+对DGPx4活力有一定的抑制作用,Ca2+和Zn2+对DG-Px4活力则无明显的促进或抑制作用.[结论]从鸭肝细胞中克隆获得的DGPx4基因序列经定点突变后可在原核细胞中高效表达,且纯化后的高纯度融合蛋白DGPx4具有GPx4活力,能在抗脂质氧化过程中发挥作用.