文献类型： 中文期刊

作者： 刘艳超 ¹ ; 王宇凡 ¹ ; 钱柯帆 ¹ ; 张峻 ² ; 肖辰鹏 ² ; 邢来君 ¹ ; 李明春 ¹ ;

作者机构： 1.南开大学

2.天津市林业果树研究所

关键词： 红色亚栖热菌;海藻糖合酶;定向进化;易错PCR;分段DNA shuffling

期刊名称： 微生物学通报

ISSN： 0253-2654

年卷期： 2013 年 40 卷 02 期

页码： 362-372

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】红色亚栖热菌(Meiothermus ruber)海藻糖合酶(Trehalose synthase,M-TreS)将麦芽糖转化生成海藻糖只需一步反应,且具有很好的热稳定性及pH耐受性,是潜在的工业生产海藻糖的酶源。为了提高该酶的性能,有必要对其进行定向进化。【方法】M-TreS基因(M-treS)大小为2 889 bp。该蛋白质分子本身具有很大的进化空间,但是却不宜进行全长基因Shuffling。分段DNA shuffling是为大分子蛋白质(基因≥2 000 bp)的进化而设计的一种方法。该方法分为三步:(1)用两对引物分别扩增目的基因的上游片段和下游片段;(2)上下游片段各自进行Shuffling;(3)利用重叠延伸PCR连接上下游突变群,建立完整基因的突变文库。【结果】结合易错PCR,通过该方法经一轮进化获得一株酶活力是野生型1.6倍、催化效率是野生型2倍的突变株。序列分析表明,该突变株共有6个位点发生了氨基酸的替代,其中一个来自易错突变,2个来自同源重组,3个为随机突变。【结论】分段DNA shuffling是进化大分子蛋白质的有效方法。