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利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联技术构建产肠毒素大肠杆菌LT敲除菌株

文献类型： 中文期刊

作者： 檀克勤 1 ; 马现永 1 ; 崔艺燕 1 ; 田志梅 1 ; 邓盾 1 ;

作者机构： 1.广东省农业科学院动物科学研究所农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室畜禽育种国家重点实验室;广东省动物育种与营养公共实验室广东省禽肉品质质量安全控制与评定工程技术中心

关键词： 产肠毒素大肠杆菌(ETEC);CRISPR/Cas9;λ-Red同源重组系统;热不稳定性肠毒素

期刊名称： 中国畜牧兽医

ISSN： 1671-7236

年卷期： 2020 年 03 期

页码： 666-675

收录情况： 北大核心

摘要： 本研究旨在利用CRISPR/Cas9和λ-Red级联的技术对产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K88的热不稳定性肠毒素(heat-labile toxin,LT)基因进行无痕敲除并获得K88 LT~-缺陷菌株。通过序列比对获取LT两端同源序列,并构建包含LT边界、氯霉素筛选标记、sgRNA和LT同源臂的供体片段;将供体片段转化至ETEC K88,同时分别利用λ-Red同源重组系统和CRISPR/Cas9基因编辑系统,对LT基因进行敲除;通过PCR验证获得了K88 LT~-缺陷菌株,并通过试验测定了敲除菌株的溶血能力和生长曲线。结果显示,λ-Red同源重组系统可成功地将LT基因替换为相应的供体片段,CRISPR/Cas9基因编辑系统可高效地对筛选标记进行删除,最终通过λ-Red和CRISPR/Cas9结合的基因编辑系统可成功对ETEC K88的LT基因进行无痕敲除。体外试验结果表明,K88 LT~-缺陷菌株的溶血能力丧失,并且生长速度比野生型菌株减缓,LT可能和ETEC K88的致病能力和生长性能有关。表明λ-Red和CRISPR/Cas9级联的基因敲除方法可用于LT毒素基因及其他一些大肠杆菌基因的敲除。K88 LT~-缺陷菌株的构建为下一步研究LT毒素的致病机制奠定基础。

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