文献类型： 中文期刊

作者： 黄秋艳 ¹ ; 杨烨城 ¹ ; 张昆丽 ² ; 孟繁明 ³ ; 李剑豪 ³ ; 朱向星 ¹ ; 王塑天 ³ ; 唐冬生 ¹ ;

作者机构： 1.佛山科学技术学院生命科学与工程学院/广东省动物分子设计与精准育种重点实验室/广东省基因编辑工程技术研究中心

2.广东省农业科学院动物卫生研究所/广东省畜禽疫病防治研究重点实验室/农业农村部兽用药物与诊断技术广东科学观测实验站

3.广东省农业科学院动物科学研究所/畜禽育种国家重点实验室/广东省畜禽育种与营养研究重点实验室

关键词： CRISPR/Cas9;STING基因;猪肺泡巨噬细胞;基因敲除;I型干扰素

期刊名称： 南方农业学报

ISSN： 2095-1191

年卷期： 2022 年 53 卷 004 期

页码： 891-898

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： [目的]阐明干扰素基因刺激因子(STING)在猪抗病原微生物感染中的作用机制,为猪传染性胃肠炎、流行性腹泻和猪伪狂犬病等病毒性疾病的科学防控提供参考依据.[方法]基于CRISPR/Cas9技术,在STING基因第4、第8外显子中寻找高分靶点并设计sgRNA序列,将退火的sgRNA与酶切的LentiCRISPRv2载体用T4 DNA连接酶连接以获得LentiCRISPRv2-STING-sgRNA慢病毒载体(STING-sgRNA);以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞,得到含sgRNA的慢病毒再转染3D4/21细胞;经嘌呤霉素筛选和有限稀释法获得单克隆细胞株,通过PCR、测序及Western blotting鉴定STING基因的敲除效果;并采用实时荧光定量PCR验证STING基因敲除对I型干扰素表达的影响.[结果]以不同的STING-sgRNA慢病毒载体组合与HA-STING过表达载体共同转染293T细胞,均能在细胞内对STING真核表达载体产生编辑效果,且以STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合的编辑效率最高.以编辑效率最高的STING-sgRNA(1+5)慢病毒载体组合及包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共同转染293T细胞包装出慢病毒,再用慢病毒感染3D4/21细胞,结果获得1株STING基因大片段(4989 bp)缺失的3D4/21细胞株,Western blotting检测未发现STING蛋白,说明STING基因敲除3D4/21细胞(3D4/21-STING-/-)构建成功.与野生型3D4/21细胞相比,在转染副猪嗜血杆菌DNA刺激下,3D4/21-STING-/-细胞中的IFN-β基因转录水平显著降低(P<0.05).[结论]采用CRISPR/Cas9技术能成功大片段敲除3D4/21细胞中的STING基因,而导致STING基因功能丧失;STING基因敲除会导致细胞在病原微生物DNA刺激时I型干扰素转录障碍,也提示STING基因可能是猪抗病原微生物感染的关键因子.