科研产出
马立克病病毒编码的mi R-M4-5 p调控宿主靶基因的筛选及鉴定
《畜牧兽医学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：血清1型马立克病病毒(MDV-1)感染引起的鸡马立克病(MD)一直以来被认为是研究病毒诱导肿瘤发生机制的理想模型.此前研究发现,MDV-1编码的miR-M4-5p是宿主癌基因miR-155的病毒同源物,从基因组中敲除miR-M4-5p可显著降低MDV-1的致病性和致瘤性,表明miR-M4-5p可能是MDV-1诱导肿瘤发生的重要调控因子.为进一步揭示miR-M4-5p的调控机制,以CEF细胞总RNA反转录产物cDNA为模板,利用hybrid-PCR技术构建了miR-M4-5p的候选靶基因文库.通过基因克隆、PCR鉴定及序列比对分析,获得128个候选基因序列,有73个基因的3′-UTR存在miR-M4-5p的潜在结合靶点,其中23个3′-UTR结合靶点与miR-M4-5p完全互补配对.通过双荧光素酶报告试验和qRT-PCR分析,对miR-M4-5p与3′-UTR的体内外相互作用以及候选靶基因的表达水平进行分析和验证,最终鉴定DPT、TMEM230和DCLK1为miR-M4-5p调控的宿主靶基因.本研究为后续进一步阐明miR-M4-5p在MD肿瘤发生中的调控机制奠定了重要基础.
关键词： MDV miRNA 宿主靶基因 肿瘤发生 hybrid-PCR
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不同花生品种抗旱性评价
《花生学报 》 2020
摘要：干旱是影响花生生产的主要非生物胁迫之一.为评价不同花生品种的抗旱性差异,选用6个花生品种,研究了20%聚乙二醇(PEG-6000)模拟干旱胁迫对不同花生品种生长发育及生理指标的影响.6个品种的平均隶属函数值介于0.22~0.76,品种间差异较大,豫花9326的失水率、可溶性糖、一氧化氮、类黄酮的隶属函数值均较大,豫花15的叶绿素、花青素含量的函数值较大,而湘花2008的失水率、叶绿素、类黄酮、一氧化氮的函数值均较小.根据综合隶属函数值分析,6个品种的抗旱性强弱排序为豫花9326>豫花15>花育34>ST001>远杂9847>湘花2008,即豫花9326、豫花15的抗旱性较强,花育34、ST001、远杂9847的抗旱性一般,湘花2008抗旱性较差.
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建马立克病病毒超强毒株原癌基因meq缺失株及其鉴定
《病毒学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：近年来,CRISPR/Cas9基因编辑技术正迅速应用于大基因组DNA病毒的编辑,尤其是一些致瘤性疱疹病毒.马立克病病毒(Marek's disease virus,MDV)属于甲亚科疱疹病毒,血清I型MDV(MDV-1)感染自然宿主可诱导快速发作的T细胞淋巴瘤.meq基因是MDV-1致瘤的主要原癌基因,在马立克病(Marek's disease,MD)肿瘤发生中具有重要作用.本文以超强毒MDV(very virulent MDV,vvMDV)国际代表株Md5和我国分离株GX0101为研究对象,设计合成了多组meq基因特异性gRNA,利用CRISPR/Cas9系统成功构建了两个meq基因缺失的毒株Md5△meq-C45和GX0101△meq-C56,并对病毒基因组相关区域进行PCR扩增和测序.结果证实,meq基因被完全编辑并敲除.间接免疫荧光实验(Indirect immunofluorescence assay,IFA)显示,MEQ蛋白在两个meq基因编辑毒株感染的CEF细胞中均无表达,并且meq基因缺失经连续15次传代仍保持稳定.通过荧光定量PCR(quantitative PCR,qPCR)对病毒增殖曲线进行测定,证实meq基因编辑不影响病毒的体外复制.本研究建立了CRISPR/Cas9系统快速编辑MDV-1病毒基因的技术方法,获得了稳定的meq基因缺失毒株,为后续MDV-1的致病及致瘤机制研究、MEQ单抗筛选鉴定及诊断试剂研发等奠定了重要基础.
关键词： 马立克病病毒(MDV) meq基因 CRISPR/Cas9 基因编辑
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5%环磺酮可分散油悬浮剂在玉米田应用的除草效果及其安全性
《杂草学报 》 2020
摘要：为测定环磺酮对玉米田一年生杂草的除草效果,确定其使用剂量及加入安全剂对其除草效果的影响,同时测定环磺酮与烟嘧·莠去津混用的药效及安全性。选择5%环磺酮可分散油悬浮剂进行田间试验,并与玉米田常用除草剂15%硝磺草酮可分散油悬浮剂、30%苯唑草酮悬浮剂、24%烟·硝·莠去津可分散油悬浮剂的防效作对比。结果表明,试验各处理对玉米无明显影响,从总草防效对比可以看出,硝磺草酮150 g a.i/hm~2处理与环磺酮105 g a.i/hm~2处理差异不显著,与环磺酮120 g a.i/hm~2处理差异显著,说明环磺酮活性比硝磺草酮高;苯唑草酮+助剂处理的防效与环磺酮105 g a.i/hm~2处理差异不显著。加安全剂的处理与同剂量无安全剂的处理防效无显著性差异,说明安全剂的加入对环磺酮除草活性无影响;环磺酮+烟嘧·莠去津90+450 g a.i./hm~2进行处理,结果显示其防效与环磺酮单用处理差异显著,且比烟·硝·莠去津720 g a.i./hm~2处理的防效高,但差异不显著。建议可以根据田间杂草发生情况进行环磺酮105～120 g a.i./hm~2与环磺酮+烟嘧·莠去津90+450 g a.i./hm~2交替使用,既可以保证防效,也可以延缓药剂的抗性。
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450g/L二甲戊灵微囊悬浮剂对小麦田杂草防除效果与安全性
《杂草学报 》 2020
摘要：为明确二甲戊灵微囊悬浮剂土壤封闭处理对小麦田一年生杂草防除效果及对不同品种小麦的安全性,采用土壤喷雾法进行田间药效试验。结果表明,450 g/L二甲戊灵微囊悬浮剂在剂量为472.5、743.0、1 012.5 g a.i./hm~2下,对小麦田一年生杂草播娘蒿、荠菜的株防效、鲜重防效均在80.70%以上;对耿氏硬草的防效略差。相同有效成分下,450 g/L二甲戊灵微囊悬浮剂在药后90 d和120 d对杂草的防除优于330 g/L二甲戊灵乳油。450 g/L二甲戊灵微囊悬浮剂对不同品种(矮抗58、郑麦103、百农207)小麦均较安全,增产率为7.81%～11.67%。因此,450 g/L二甲戊灵微囊悬浮剂可用于播后苗前土壤处理以防除麦田杂草,且对小麦安全,推荐剂量为743.0～1 012.5 g a.i./hm~2。
关键词： 小麦 二甲戊灵 微囊悬浮剂 除草剂 防除效果 安全性
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菊花田苗后除草剂品种筛选及安全性评价
《杂草学报 》 2020
摘要：通过室内外试验评估24种苗后除草剂对菊花的安全性和除草效果。盆栽试验结果表明,24种苗后除草剂单剂处理中咪唑乙烟酸、硝磺草酮甲咪唑烟酸、草除灵、扑草净等对菊花相对安全,这几种药剂不同剂量下对菊花的药害级别均低于或等于2级。田间试验测定甲咪唑烟酸、咪唑乙烟酸对菊花的安全性及杂草防除效果表明,67.5、90.0 g/hm~2 5%咪唑乙烟酸AS对各种杂草的防效较好,但药后26 d对菊花的生长抑制率为30%左右,药害严重。108 g/hm~2 24%甲咪唑烟酸AS处理条件下,对菊花生长无显著抑制作用,对反枝苋、牛筋草、马泡瓜等杂草均具有较好的防治效果,对马齿苋、醴肠、稗草、马唐、藜等杂草具有中等防效。表明108 g/hm~2 24%甲咪唑烟酸AS是较为理想的菊花田苗后除草剂。
关键词： 菊花 杂草防除 苗后除草剂 防效 安全性 咪唑乙烟酸 甲咪唑烟酸
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猪瘟病毒E~(rns)蛋白在杆状病毒表达系统中的分泌表达及活性检测
《河南农业科学 》 2020 北大核心
摘要：为制备用于ELISA检测猪瘟病毒的E~(rns)蛋白,根据昆虫细胞密码子偏好性对E~(rns)的基因序列进行优化,将优化后的E~(rns)基因插入带有信号肽的表达载体pFastBacl-gp67中;随后将重组质粒pFastBacl-gp67-E~(rns)转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑选白斑,提取重组黏粒Bacmid-E~(rns);将重组黏粒转染sf21细胞得到杆状病毒,经扩增后得到P_3病毒,利用其大量感染细胞,3 d后收取细胞培养上清;通过镍填料纯化得到分泌表达的E~(rns)蛋白,通过SDS-PAGE及Western blot检测分泌蛋白的表达水平、纯化情况,用PNGase F处理分析其糖基化水平,通过ELISA分析其抗原性。结果显示,成功构建了重组质粒pFastBacl-gp67-E~(rns),蓝白斑筛选获得了重组黏粒Bacmid-E~(rns),在此基础上获得了重组杆状病毒,利用其感染sf21细胞,成功分泌表达了E~(rns)蛋白,纯化所得E~(rns)蛋白纯度较高,具有较高糖基化修饰水平,且纯化所得E~(rns)蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清,其抗原性良好。
关键词： 猪瘟病毒 E~(rns)蛋白 分泌表达 糖基化分析 活性 杆状病毒
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2017年河南省猪流行性腹泻病毒检测及基于S1基因片段的遗传变异分析
《中国兽医学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：为了解河南省引起仔猪腹泻的猪肠道冠状病毒的感染和流行情况,我们对2017年度发生仔猪腹泻的河南省25家养殖场送检的94份仔猪肠道或粪便样品开展了相关检测。结果显示猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)的样品检出率为68.1%(64/94),猪场阳性率为76.0%(19/25),但未检测到猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDcoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。为进一步分析PEDV的遗传变异情况,利用RT-PCR和基因克隆测序技术,我们成功获得了8株PEDV的S1基因片段的核苷酸序列。分子进化树分析显示,我国流行毒株可以分为G1a(疫苗及其衍生株)、G1b(经典毒株)、G2a(2011-2013年变异株)、G2b(2016-2017年变异株)和G2c(重组毒株)5个进化分支,本研究获得的S1基因序列均处于G2b进化分支,且与2016-2017年间的流行毒株遗传距离更近。同源性分析显示,8株分离株彼此之间S1基因片段的核苷酸同源性为97.3%～99.5%,与变异毒株AJ1102的同源性为97.2%～98.0%,而与经典毒株CV777、CH/S的同源性仅为91.0%～92.3%。氨基酸序列比对分析显示,与CV777和CH/S等经典毒株相比,分离株S1基因片段除了多个氨基酸位点发生变异外,在~(58)NQGV~(61)、~(140)N、~(157)H这3个位置有氨基酸的插入,在~(163)NI~(164 )有2个氨基酸的缺失,这与之前关于PEDV变异株的研究报道相一致。此外,与其他变异株相比,本研究发现分离株HeNPDS/2017在491位有1个新的丝氨酸(Ser)缺失位点,其生物学意义有待进一步研究。本研究丰富了PEDV的分子流行病学数据,有助于了解河南省PEDV流行和遗传变异的最新情况,为该地区猪流行性腹泻病的防控提供一定的参考。
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猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究
《动物医学进展 》 2020 北大核心
摘要：猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。
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