科研产出
重组T7噬菌体生物学特性的研究
《动物医学进展 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：以大肠埃希菌BL21为宿主菌研究重组T7噬菌体生物学特性。将构建好的重组T7噬菌体扩增纯化,分析其对pH、温度及离子浓度的敏感性,并将重组噬菌体与宿主菌以不同比例混合测定最佳感染复数并绘制其一步生长曲线。结果表明,重组T7噬菌体的热稳定性较弱,在60℃时20min效价明显下降,在70℃时5min内即会全部失活;pH 4~11的范围内重组T7噬菌体均可稳定存在;培养基中Mg2+浓度为10mmol/L及Ca2+浓度为5mmol/L时最有利于噬斑的形成,出斑率提高了约20%;重组噬菌体感染其宿主大肠埃希菌的最佳感染复数为10-5;其一步生长曲线的潜伏期约30min,裂解期约150min,裂解量为126pfu/cell。构建的重组T7噬菌体具有较强的裂解能力,潜伏期短,裂解量大,对理化因素稳定性好,为进一步大规模、高效率制造口蹄疫表位疫苗提供了理论基础。
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从蛋白质和转录水平鉴定类猪圆环病毒P1存在ORF2和ORF3
《中国农业科学 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】确定类猪圆环病毒P1存在开放阅读框ORF2和ORF3;【方法】采用Trizol法,提取类猪圆环病毒P1分子克隆转染PK-15细胞的总RNA,纯化之后,分别用P1 ORF2和ORF3特异性引物进行RT-PCR,应用AxyPrepTM DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物,转化Trans5α感受态细胞,挑取单菌落,经PCR检测为阳性后测序。同时,利用rapid-amplification of cDNA ends(RACE)技术分别扩增P1病毒ORF2和ORF3的5′-与3′-末端。另外,根据P1 ORF2和ORF3的序列预测其B细胞抗原表位,采用标准的逐步固相合成法合成表位肽,与载体蛋白KLH偶联后,免疫新西兰大白兔制备抗P1 ORF2和ORF3的多克隆抗体。采用常规间接ELISA法检测分离血清效价,包被抗原用合成肽,450 nm波长下测定,血清抗体效价为S/N≥2.1的血清最高稀释度。然后,用P1双拷贝分子克隆转染PK-15细胞,通过免疫组化方法对该多抗与P1的反应性进行检测,同时利用实时荧光定量PCR方法检测转染细胞中P1的拷贝数。【结果】利用ORF2和ORF3特异性引物对P1 RNA进行的RT-PCR,均能扩增出目的片段,回收测序大小分别为111 bp和128 bp,分别与P1 ORF2和ORF3进行同源性比较,序列同源性均为100%;RACE技术分析,得到P1 ORF2的5′-和3′-RACE末端分别为第11位(G)和第168位(T),P1 ORF3的5′-和3′-RACE末端分别为第285位(T)和第579位(A)。根据预测结果,合成肽的氨基酸序列分别为ORF2:CLSRLPQSERPPGRW和ORF3:CVYPKVRERRVLKMP;用ORF2和ORF3表位肽与载体蛋白KLH的偶联物免疫新西兰大白兔制备的多克隆抗体效价均达到1﹕512 000以上,并且能够与P1病毒发生特异性显色反应,应用蓝色DAB显色试剂盒染色结果为紫蓝色,多数在细胞浆,少数在细胞核,而对照组细胞无显色反应。定量PCR检测结果显示,P1可以在转染P1双拷贝分子克隆的PK-15细胞中复制,并且转染后104 h增殖量达最大。【结论】通过转录分析和免疫组化试验分别从转录和蛋白质水平上证实了类猪圆环病毒P1存在ORF2和ORF3。
关键词： P1 ORF2 ORF3 RT-PCR RACE 免疫组化
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不同地理种群二化螟Ty3/gypsy反转座子天冬氨酰蛋白酶(AP)基因序列的克隆与分析
《昆虫学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】Ty3/gypsy反转座子是广泛存在于生物体内的一类反转座子。反转座子上的天冬氨酰蛋白酶(aspartic protease,AP)基因是反转座子发生转座所需的一个重要基因。但由于该基因家族成员间变异较大,较难利用简并引物克隆得到该基因,所以对该基因家族成员的研究很少。【方法】本研究采用PCR方法克隆了二化螟Ty3/gypsy反转座子的AP基因序列,并对其序列特征和地理种群变异进行了分析。【结果】克隆获得的二化螟Chilo suppressalis(Walker)Ty3/gypsy反转座子中的AP基因具有独立的开放阅读框(open reading frame,ORF),长528 bp,编码的蛋白含175个氨基酸残基(GenBank登录号:KF886014)。Conserved Domain Search在线工具分析显示,该蛋白中含有一个特异的Asp_protease_2保守功能域。从7个二化螟不同地理种群中共克隆获得70份AP基因拷贝。对同一基因座位上的AP序列多重比对分析,发现共存在46处碱基替换,其中碱基转换(transition)有31处,碱基颠换(transversion)有15处,70份拷贝中有69份拷贝是完整的ORF,能编码完整的蛋白。从碱基替换形式看,A→G的变异形式出现最多,有15处;其次是T→C的变异形式,有11处;其余的变异形式都很少。对比这7个不同地理种群,没有发现碱基的替换存在明显的地理区划差异。【结论】碱基的替换形式与二化螟所处的地理区域无明显相关性。本研究对于认识反转座子序列的变异特点有所帮助。
关键词： 二化螟 反转座子 Ty3/gypsy 天冬氨酰蛋白酶 基因克隆 序列分析
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温度对番茄根结线虫抗性相关基因表达的影响
《江苏农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为阐明番茄抗根结线虫基因Mi-1在土壤温度高于28℃时丧失抗性的原因,选用3份番茄材料Motelle(Mi-1)、LA2157(Mi-9)和新选育获得的具有热稳定抗根结线虫特性的栽培番茄材料ZN17(Mi-HT)进行研究。通过根结线虫的人工接种鉴定,确定Motelle在高温条件下丧失抗性,而ZN17和LA2157在高温条件下仍然具有良好的抗性。利用特异引物对各番茄材料的c DNA模板进行扩增、测序和序列比对分析,发现这3份材料扩增片段具有很高的相似性,因此利用该引物对各材料高温和常温条件下的基因表达变化进行分析,结果表明,Mi-1在高温条件下不表达是番茄材料Motelle高温条件下对根结线虫抗性丧失的原因。番茄材料LA2157和ZN17中扩增得到的相关基因表达状况与其在高温条件下对根结线虫的抗性表现相吻合。
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早熟型多花黑麦草生产性能及饲用品质研究
《草地学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为适应不同耕作制度以及作物茬口的需要,筛选具有较好生产性能的速生牧草品种,以6个早熟型多花黑麦草(Lolium multiflorum)品种为材料,研究了不同品种的生长适应性和饲草品质。结果表明:6个品种(系)表现为越冬后早生速生,全生育期195~200d,饲草产量主要集中于4月初的第1次刈割,约占总产量的50%。生物产量在不同品种之间差异显著(P<0.05),其中LM015生物产量最高,为12750kg·hm-2,Waseaoba次之,产量为12532kg·hm-2,Sachiaoba最低,为11542kg·hm-2。随生育期的推进,各品种的酸性洗涤纤维和中性洗涤纤维含量增加,可溶性碳水化合物含量降低,干物质体外消化率下降。不同品种的单位面积总可消化养分产量存在显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)差异,LM015的总可消化养分极显著高于其他品种(P<0.01),为8770kg·hm-2。综合饲草产量和饲草品质,LM015最好,Waseaoba次之,均适合该南京地区栽培利用。
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~(15)N示踪的水稻氮肥利用率细分
《作物学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：以粳稻武运粳23和超级杂交籼稻Y两优2号为供试品种,应用15N示踪方法研究不同时期施肥对水稻不同阶段氮肥利用率的影响,以确定不同时期施肥的最佳阶段氮肥利用率。结果表明,基肥在基肥阶段(移栽后的8 d左右)的吸收利用较低,2012年水稻基肥氮(15N)吸收量不到5 kg hm–2,2013年最大为7.5 kg hm–2,回收利用率在1.5%~11.5%之间;基肥主要是在蘖肥阶段(分蘖肥与穗肥之间)被吸收,其回收利用率在6.6%~24.9%之间,平均为15.6%;穗肥阶段(穗肥后到成熟)基本不再吸收基肥。基肥氮的总体恢复利用效率不高,在9.1%~22.8%之间,品种及氮肥运筹对基肥氮的总体恢复利用效率影响不显著。蘖肥主要在蘖肥阶段发生作用,施穗肥后水稻基本不再吸收蘖肥。蘖肥的总体恢复吸收利用率和基肥相当,在17%~34%之间,Y两优2号高于武运粳23。穗肥的回收效率最高,在54.0%~82.1%之间,武运粳23低于Y两优2号。水稻在整个生育期的总体氮肥恢复效率随氮肥用量的增加而下降,变化在32%~64%之间。水稻一生中吸收积累的氮素中,基肥的贡献占4.13%~10.59%(平均6.92%),蘖肥占3.98%~11.75%(平均7.58%),穗肥占13.32%~37.56%(平均26.02%),土壤的贡献在45.71%~70.83%(平均59.91%)之间。基蘖肥用量越大,其损失也越大,总体氮肥利用率也越低。研究结果证明,在水稻氮肥管理中必须考虑水稻各阶段对不同时期施肥的吸收利用情况,从而提高水稻氮肥利用效率,保证产量的同时减少不必要的损失。
关键词： 水稻 氮肥管理 15N示踪法 不同施肥阶段 氮肥利用率
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玉米籽粒低氧胁迫发芽期间主要生理生化和γ-氨基丁酸含量变化
《食品科学 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：以玉米籽粒为材料研究低氧胁迫下籽粒发芽过程中主要生理生化和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量变化,筛选出最适富集GABA的玉米品种。结果表明:5个品种玉米籽粒在72 h低氧胁迫发芽期间,芽长增长15.5~26.3 mm,呼吸强度提高1.7~3.2倍,干物质损失35.6%~40.6%,淀粉消耗15.5%~28.9%,还原糖和游离氨基酸含量分别增加1.7~4.7倍和7.4~13.3倍,GABA含量提高9.3~13.2倍,不同品种玉米籽粒发芽能力和GABA富集量呈显著差异,以京甜紫花糯(ZHN)品种发芽率最高,达到85.5%,且GABA富集量达到0.65mg/g(以干质量计),ZHN是富集GABA的最适玉米品种。低氧胁迫下发芽玉米中GABA含量与芽长、呼吸强度、游离氨基酸呈极显著正相关(P<0.01),玉米经低氧胁迫发芽能提升玉米营养品质。
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桃不同发育时期主要糖类含量和蔗糖合成酶基因表达水平的动态变化
《江苏农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为了揭示桃不同发育时期的果实、叶片、韧皮部中主要糖类含量的动态变化及其机理,以水蜜桃品种湖景蜜露为材料,采用高效液相色谱仪测定花后45 d、65 d、85 d、105 d时果实、叶片、韧皮部中蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇含量,并利用荧光定量PCR测定6个蔗糖合成酶基因的表达水平。结果显示,湖景蜜露果实以积累蔗糖为主,叶片和韧皮部以积累山梨醇为主,是典型的葡萄糖/果糖≈1的品种。花后105 d时果实中,蔗糖含量最高,其次是果糖和葡萄糖,山梨醇含量最低;相反,花后45~105 d,韧皮部和叶片的山梨醇含量均最高,蔗糖含量最低。花后45 d果实中蔗糖含量最低,盛花后85 d达到最高值,随后下降直到采收;花后45~105 d果实中葡萄糖、果糖、山梨醇含量的变化趋势与蔗糖相反。花后45~105 d,果实中果糖和葡萄糖含量显著高于叶片和韧皮部,而叶片和韧皮部之间无显著差异。花后65 d至果实采收期间叶片中山梨醇含量与果实中蔗糖含量变化趋势非常相似。果实和韧皮部发育过程中Pp Sus3远远高于其他基因的表达水平,Pp Sus1在叶片的整个发育过程中表达水平最高。表明Pp Sus3在果实和韧皮部、Pp Sus1在叶片中对糖类代谢可能具有更重要作用。
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乌骨绵羊NR5A2基因编码区序列克隆及特征分析
《江苏农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为了研究NR5A2基因在乌骨绵羊中的序列特征,利用PCR和克隆测序技术获得乌骨绵羊NR5A2基因的外显子序列,用DNAMAN软件和DNAStar软件对序列进行比对和拼接、运用Clustal软件与其他物种相应序列进行同源比对分析,MEGA5.1软件用来构建哺乳动物NR5A2蛋白质系统进化树,用DNA池方法对其编码区序列的SNPs位点进行筛选。结果显示:乌骨绵羊NR5A2基因编码区全长1 488 bp,共编码495个氨基酸;乌骨绵羊的NR5A2基因编码区核苷酸序列与湖羊和牛的同源性分别为99.87%和85.51%;氨基酸序列的一致性分别为99.41%和89.66%。与湖羊相比,乌骨绵羊NR5A2基因编码区共发现3个单碱基突变(C1069A、C1419T和G1485A),其中C1069A位点突变引起了氨基酸的改变,从亮氨酸变为异亮氨酸。在乌骨绵羊的编码区现了一个单核苷酸突变位点G999C。
关键词： 乌骨绵羊 NR5A2基因 基因克隆 序列分析 单核苷酸多态性
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