文献类型： 中文期刊

作者： 何永盛 ¹ ; 陈舒迟 ¹ ; 王弘 ¹ ; 韩双艳 ² ; 杨琼 ³ ; 刘细霞 ¹ ; 董洁娴 ¹ ; 杨武英 ¹ ; 孙远明 ¹ ;

作者机构： 1.广东省食品质量与安全重点实验室/华南农业大学食品质量与安全研究所

2.华南理工大学生物科学与工程学院

3.广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所

关键词： 毕赤酵母;重组家蚕乙酰胆碱酯酶;表达;活性分析;有机磷农药;氨基甲酸酯类农药

期刊名称： 中国农业科学

ISSN： 0578-1752

年卷期： 2012 年 45 卷 11 期

页码： 2189-2198

收录情况： 北大核心 ; CSCD

摘要： 【目的】构建表达家蚕乙酰胆碱酯酶(BmAChE)的毕赤酵母菌株,实现BmAChE在毕赤酵母中分泌表达并对其活性进行分析。【方法】从家蚕头部提取总RNA,经RT-PCR反转录成cDNA,通过PCR扩增出家蚕乙酰胆碱酯酶基因bmace并进行序列测定。采用PCR及重叠延伸PCR去除原bmace中的信号肽和疏水肽,并对序列中存在的2个A+T富含区进行同义密码子替换的改造。将改造后的bmace与表达载体pPIC9K连接,转化毕赤酵母GS115,甲醇诱导表达。SDS-PAGE和Western blotting鉴定重组蛋白,以Ellman法测定酶活力,毒扁豆碱和有机磷及氨基甲酸酯类农药抑制试验分析重组BmAChE(rBmAChE)的生物活性。【结果】改造后的bmace经重组毕赤酵母菌株分泌表达了1个分子量约为70 kD的蛋白,具有AChE活性,酶比活力约为1 187 U.mg-1。抑制试验显示,该rBmAChE能够被毒扁豆碱强烈抑制,并且可被皮蝇磷等10种有机磷农药和克百威等5种氨基甲酸酯类农药抑制,最低抑制浓度IC50值可达2.78×10-10mol.L-1。【结论】成功构建分泌表达BmAChE的毕赤酵母菌株,其表达了具有良好活性的rBmAChE,可用于进一步制备有机磷及氨基甲酸酯类农药快速检测分析制剂。