科研产出
猪瘟病毒E~(rns)蛋白在杆状病毒表达系统中的分泌表达及活性检测
《河南农业科学 》 2020 北大核心
摘要：为制备用于ELISA检测猪瘟病毒的E~(rns)蛋白,根据昆虫细胞密码子偏好性对E~(rns)的基因序列进行优化,将优化后的E~(rns)基因插入带有信号肽的表达载体pFastBacl-gp67中;随后将重组质粒pFastBacl-gp67-E~(rns)转化至DH10Bac感受态细胞,经蓝白斑筛选,挑选白斑,提取重组黏粒Bacmid-E~(rns);将重组黏粒转染sf21细胞得到杆状病毒,经扩增后得到P_3病毒,利用其大量感染细胞,3 d后收取细胞培养上清;通过镍填料纯化得到分泌表达的E~(rns)蛋白,通过SDS-PAGE及Western blot检测分泌蛋白的表达水平、纯化情况,用PNGase F处理分析其糖基化水平,通过ELISA分析其抗原性。结果显示,成功构建了重组质粒pFastBacl-gp67-E~(rns),蓝白斑筛选获得了重组黏粒Bacmid-E~(rns),在此基础上获得了重组杆状病毒,利用其感染sf21细胞,成功分泌表达了E~(rns)蛋白,纯化所得E~(rns)蛋白纯度较高,具有较高糖基化修饰水平,且纯化所得E~(rns)蛋白能特异性识别猪瘟阳性血清,其抗原性良好。
关键词： 猪瘟病毒 E~(rns)蛋白 分泌表达 糖基化分析 活性 杆状病毒
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2017年河南省猪流行性腹泻病毒检测及基于S1基因片段的遗传变异分析
《中国兽医学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：为了解河南省引起仔猪腹泻的猪肠道冠状病毒的感染和流行情况,我们对2017年度发生仔猪腹泻的河南省25家养殖场送检的94份仔猪肠道或粪便样品开展了相关检测。结果显示猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhoea virus,PEDV)的样品检出率为68.1%(64/94),猪场阳性率为76.0%(19/25),但未检测到猪传染性胃肠炎病毒(porcine transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDcoV)和猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhoea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。为进一步分析PEDV的遗传变异情况,利用RT-PCR和基因克隆测序技术,我们成功获得了8株PEDV的S1基因片段的核苷酸序列。分子进化树分析显示,我国流行毒株可以分为G1a(疫苗及其衍生株)、G1b(经典毒株)、G2a(2011-2013年变异株)、G2b(2016-2017年变异株)和G2c(重组毒株)5个进化分支,本研究获得的S1基因序列均处于G2b进化分支,且与2016-2017年间的流行毒株遗传距离更近。同源性分析显示,8株分离株彼此之间S1基因片段的核苷酸同源性为97.3%～99.5%,与变异毒株AJ1102的同源性为97.2%～98.0%,而与经典毒株CV777、CH/S的同源性仅为91.0%～92.3%。氨基酸序列比对分析显示,与CV777和CH/S等经典毒株相比,分离株S1基因片段除了多个氨基酸位点发生变异外,在~(58)NQGV~(61)、~(140)N、~(157)H这3个位置有氨基酸的插入,在~(163)NI~(164 )有2个氨基酸的缺失,这与之前关于PEDV变异株的研究报道相一致。此外,与其他变异株相比,本研究发现分离株HeNPDS/2017在491位有1个新的丝氨酸(Ser)缺失位点,其生物学意义有待进一步研究。本研究丰富了PEDV的分子流行病学数据,有助于了解河南省PEDV流行和遗传变异的最新情况,为该地区猪流行性腹泻病的防控提供一定的参考。
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猪瘟病毒E2蛋白酵母表达及其免疫活性研究
《动物医学进展 》 2020 北大核心
摘要：猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病,呈世界性分布,对养猪业危害严重。猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属,在自然条件下只感染猪。E2蛋白是猪瘟病毒的重要结构蛋白,也是猪瘟病毒的主要保护性抗原。以猪瘟病毒E2蛋白胞外区基因为模板,构建毕赤酵母表达载体pPICZαA-E2,并通过电转获得毕赤酵母X-33阳性克隆,经SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出猪瘟病毒E2蛋白表达菌株。通过亲和层析技术纯化蛋白,并将蛋白免疫动物,进行免疫原性分析。结果表明,猪瘟病毒E2蛋白在毕赤酵母中成功分泌性表达,经纯化纯度达95%以上;动物试验显示,该蛋白具有良好的免疫原性,为猪瘟病毒亚单位疫苗及相关检测技术的开发奠定了基础。
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高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术测定富硒香菇中的硒形态
《食品科技 》 2020 北大核心
摘要：建立了一种富硒香菇中硒形态的提取方法,采用高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术对富硒香菇中提取到的不同硒形态进行测定,并通过测定方法的检出限、精密度以及回收率对该方法进行评价.结果表明:该方法线性良好,各种硒形态标准曲线线性相关系数(r)均大于0.9993,检出限为0.94~5.10 μg/L,回收率为75.8%~99.6%,精密度RSD/%(n=7)均不超过4.0.该方法操作简单、无需酶解、成本低且绿色环保,可用于富硒香菇中硒形态的测定.
关键词： 高效液相色谱-氢化物发生-原子荧光光谱联用技术 硒形态 富硒香菇
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浅谈以水果为主题的特色小镇规划建设
《中国果树 》 2020 北大核心
摘要：经济社会的快速发展促使旅游形态的多样化,特色小镇是以特色产业为主导、资源凝聚为原则、产城融合为理念的多元化发展模式,对促进区域农业现代化和城乡融合发展具有重要的推动作用.水果主题特色小镇规划建设是果业转型升级、果旅产业融合背景下的重要实践,是以果树为载体将农业与旅游业、新农村与人居环境、乡村与城市在要素配置、产业发展、生态保护等方面进行有机联系,为城乡融合发展提供广阔思路,为乡村振兴提供不竭动力.结合乡村振兴的时代要求,对水果特色小镇规划建设的内涵、路径、形象设计进行系统论述,并从"三生融合"、人居环境建设等视角探讨水果特色小镇规划建设的方向,对丰富特色小镇内涵、打造新时代的宜居乡村具有重要的实践意义.
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秸秆还田下氮肥运筹对夏玉米不同时期土壤酶活性及细菌群落结构的影响
《植物营养与肥料学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：【目的】通过研究秸秆还田下氮肥运筹对夏玉米不同生育期土壤酶活性和细菌群落结构的影响,揭示土壤细菌群落对不同施肥措施的响应规律,为调节土壤养分,提高作物产量,改善土壤生物功能提供科学依据。【方法】基于河南农业科学院原阳试验基地5年连续定位试验,选取不施肥(CK)、单施化肥(氮肥基追比1∶1,N)和秸秆全量还田下氮肥基追比1∶1 (SN1)、1∶1.5 (SN2)和1∶2 (SN3)共5个处理,于2016年夏玉米抽丝期和收获期采集0—20 cm土壤样品,采用常规方法测定土壤基础理化性质,采用荧光微型板酶检测技术测定土壤酶活性,采用Illumina Miseq高通量测序方法测定土壤细菌群落结构。【结果】秸秆还田下氮肥基追比对玉米产量及氮肥利用率产生明显影响,相比于N处理,SN1处理显著增产9.98%;SN1和SN2处理氮肥利用率分别提高9.83、5.10个百分点。在夏玉米抽丝期和收获期,相比于N处理,秸秆还田下各氮肥运筹处理不同程度地提高了土壤pH、有机碳、全氮和速效钾含量,其中均以SN1处理增幅最为明显。在玉米抽丝期,除土壤磷酸酶外,SN1处理土壤酶活性均为最高;SN1处理对收获期土壤β-葡萄糖苷酶、纤维二糖甘酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖苷酶和酚氧化酶活性的促进最明显。细菌群落除抽丝期SN1与CK处理Shanno指数显著高于N处理而Simpson指数显著低于N处理外,其余处理间差异不显著。各施肥处理下门水平和纲水平的主要优势种群均为变形菌门、放线菌门和α-变形菌纲和放线菌纲。线性判别效应分析(LEfSe)显示,不同生育期比较,抽丝期最大LDA(linear discriminant analysis)值为酸杆菌纲,收获期为芽单胞菌纲;而同一生育期各处理间比较,抽丝期各处理最大LDA值均为变形菌门的α-变形菌纲,收获期均为γ-变形菌纲。典范对应分析表明,抽丝期土壤pH (P=0.002)、有机质含量(P=0.004)和收获期土壤pH (P=0.03)、硝态氮(P=0.036)、速效钾(P=0.044)含量对细菌群落结构产生显著影响。【结论】土壤pH、有机碳、硝态氮和速效钾含量是影响细菌群落结构变化的主要因素。秸秆还田条件下,氮肥运筹显著影响土壤酶活性和细菌群落结构,氮肥基追比为1∶1时可显著提升土壤养分含量和酶活性,提高δ-变形菌纲、绿弯菌纲和TK10 (未分类)相对丰度,从而更有效地促进秸秆分解和转化,发挥有机质调节土壤养分释放、减少养分损失的作用,最终提高玉米产量和氮肥利用率。
关键词： 秸秆还田 小麦–玉米轮作体系 氮肥运筹 高通量测序 土壤酶活性 细菌群落
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不同肥力潮土的酶活计量比特征及其与微生物量的关系
《中国农业科学 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：[目的]研究不同肥力土壤上胞外酶活性,阐明胞外酶活性计量比特征及其影响因素,为阐明土壤生物肥力差异的机制与土壤培肥提供理论依据.[方法]选取了高、中、低肥力的潮土,分析其微生物量碳、氮(SMBC、SMBN)含量以及β-1, 4-葡萄糖苷酶(β-1, 4-glucosidase,BG)、纤维二糖水解酶(Cellobiohydrolase,CBH)、β-1,4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(β-1,4-N-acetylglucosaminidase, NAG)、亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase,LAP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)活性.采用生态化学计量学方法分析该5种酶活性在不同肥力土壤间的差异,以及酶活与土壤微生物量间的定量关系.[结果]高肥力土壤SMBC是中肥力土壤的2.6倍,低肥力土壤的5.8倍;高肥力土壤SMBN为中肥力土壤的3.1倍,低肥力土壤的5.5倍.SMBC/SMBN在不同肥力土壤间无显著差异.土壤碳氮磷转化酶活性和综合酶指数均表现为高肥力土壤>中肥力土壤>低肥力土壤,且土壤胞外酶活性与微生物量碳氮表现为直线正相关关系.SMBC和SMBN每增加1 mg·kg-1,(BG+CBH)和(NAG+LAP)活性分别可提高0.134和10.53 nmol·g-1·h-1.ln (BG+CBH)﹕ln (NAG+LAP)和ln (BG+CBH)﹕ln AP均小于1,表明碳源是潮土养分转化的首要限制因素.高肥力土壤上碳、氮、磷酶活比例较低肥力土壤更接近适宜值.[结论]潮土上应配施有机肥或进行秸秆还田,保证充足的碳源以解决养分有效性限制的问题,促进氮磷的养分循环转化.适宜的活性碳氮磷比例是高肥力土壤高产高效的重要机制之一.
关键词： 潮土 土壤肥力 养分限制 生态化学计量学 微生物量碳氮 胞外酶活性
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基于结构类似物的交叉反应性制备高灵敏度玉米赤霉醇单克隆抗体
《中国农业科学 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：【目的】获取高灵敏度的玉米赤霉醇(zearalanol,ZAL)单克隆抗体,为提高玉米赤霉醇免疫学检测方法灵敏度研究奠定基础。【方法】利用ZAL的结构类似物玉米赤霉酮(zearalanone, ZAN)制备人工完全抗原。肟化改造ZAN得到ZAN-O;碳二亚胺(EDC)法把ZAN-O分别连接到牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)上制备出ZAN-O-BSA和ZAN-O-OVA。ZAN-O-BSA免疫小鼠,免疫剂量为50μg蛋白/只鼠。选取血清效价高、灵敏度好的小鼠进行细胞融合。阳性杂交瘤筛选过程中,利用ZAL替代ZAN作为阻断剂,筛选能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞。体内诱生腹水法来批量制备ZAL单抗,并对单抗的免疫学性能进行了鉴定。【结果】通过细胞融合,阳性杂交瘤筛选得到了1株能分泌抗ZAL单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为12B10A7,其分泌的ZAL单抗灵敏度(半数抑制浓度, IC50)为577 pg·mL~(-1),亲和力常数Ka=6.21×10~7 L·mol~(-1),与结构类似物β-玉米赤霉醇(β-zearalanol,β-ZAL)、α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol,α-ZEL)、β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol,β-ZEL)、玉米赤霉酮、玉米赤霉烯酮(zearalenone, ZEN)分别有43.06%、15.51%、15.22%、77.65%及9.79%的交叉反应率,而与其他霉菌毒素及载体蛋白交叉反应率均<0.06%。【结论】基于抗体交叉反应特性,利用ZAN制备人工抗原,得到了ZAL的单克隆抗体,所制备的单克隆抗体亲和力高,灵敏度好,特异性强。
关键词： 玉米赤霉醇 玉米赤霉酮 结构类似物 交叉反应 单克隆抗体
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禽腺病毒4型ZZ株的分离鉴定及系统进化分析
《河南农业科学 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：为深入研究禽腺病毒4型(FAdV-4)河南流行株的基因组特征和分子进化关系,从患有心包积水综合征的病鸡样品中分离了1株FAdV-4(FAdV-4 ZZ),并对分离毒株进行了全基因组序列分析和分子进化分析.结果表明,FAdV-4 ZZ株可在鸡肝癌细胞上稳定传代并产生明显的细胞病变.与无毒力的FAdV-4 ON1株和FAdV-4 KR5株相比,FAdV-4 ZZ株以及国内流行的CH/JSXZ/2015、JSJ13、SDSX1株均存在ORF19、ORF27、ORF30基因缺失.与国内首次分离的JSJ13株相比,FAdV-4 ZZ株的ORF29序列存在33个碱基缺失.FAdV-4 ZZ株的Hexon基因与国内流行的CH/JSXZ/2015和SDSX1株的核苷酸序列相似性均为100%,与ON1株和KR5株的Hexon基因核苷酸序列相似性分别为98.69%和98.90%.综上,成功分离了FAdV-4 ZZ株,并获得了分离毒株的全基因组序列及其与国内外相关毒株的分子进化关系.
关键词： 禽腺病毒 血清4型 分离鉴定 全基因组 系统进化分析
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