科研产出
兔肝细胞中与RHDV VP60 P2亚区相互作用蛋白质的筛选和初步鉴定
《畜牧兽医学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白VP60P2亚区在病毒感染宿主细胞过程中可能起重要作用,为找寻RHDV靶细胞——兔肝细胞中与P2亚区相互作用的蛋白质,以原核表达的P2蛋白为诱饵蛋白质,通过免疫共沉淀试验(Co-IP)结合质谱分析筛选与之有相互作用的肝细胞蛋白质。经分析选取层黏连蛋白受体(LamR)蛋白做进一步研究。提取兔肝细胞总RNA,反转录扩增LamR基因,将其插入pGEX-6p-1载体,经IPTG诱导表达,获得GST-LamR融合蛋白,并通过GST pull-down试验验证LamR蛋白与P2蛋白的结合。结果显示,以P2蛋白为诱饵蛋白质,免疫共沉淀试验结合质谱分析共筛选到26个与P2存在相互作用的肝细胞蛋白质,其中LamR蛋白是多种病毒的受体。通过原核表达系统表达了LamR蛋白,经pull-down试验验证了LamR蛋白与P2蛋白有直接的相互作用。本研究证实兔肝细胞LamR蛋白与RHDV VP60P2蛋白的相互作用,为深入研究RHDV的感染过程、揭示RHDV的致病机制提供了线索。
关键词： 兔出血症病毒(RHDV) VP60P2亚区 免疫共沉淀 层黏连蛋白受体(LamR)
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一株高效解磷菌Bacillus subtilis JT-1的筛选及其对土壤微生态和小麦生长的影响
《江苏农业学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：为开发高效解磷微生物菌肥,提高磷肥利用效率,从磷矿土壤中筛选出1株高效解磷菌,经16S r DNA鉴定为枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilis JT-1,通过钼锑抗比色法对其解磷能力进行定量分析,并通过GC-MS定性分析其代谢产物中的有机酸成分。将该解磷菌制备成菌剂施用于土壤和盆栽小麦,对土壤中有效磷含量、可培养微生物数量和微生物群落多样性进行了分析,同时测定了小麦的基本生长指标及对磷肥的利用效率。结果表明,B.subtilis JT-1在难溶磷培养基中的解磷率高达38.69%,具有分泌苹果酸、延胡索酸、琥珀酸、柠檬酸等溶磷有机酸的特性。施入土壤后可有效提高土壤中可溶磷含量和可培养微生物的数量,明显提高土壤微生物群落结构的多样性。此外,菌株JT-1还提高了磷肥的利用率10.79个百分点,促进小麦增产12.31%。因此,筛选到的解磷菌B.subtilis JT-1具有较高的理论研究意义和应用价值。
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‘宁紫薯1号’花青素组分鉴定及其对大鼠高脂诱导肥胖的预防效果
《中国农业科学 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：【目的】紫甘薯是天然抗氧化物花青素的重要来源。鉴定‘宁紫薯1号’花青素(PSPC)组成成分,探索紫甘薯花青素对高脂诱导肥胖的预防效果并探讨其分子机制。【方法】通过液质联用技术分析紫甘薯新品种‘宁紫薯1号’的花青素组分;采用p H示差法测定制备的样品中总花青素含量。建立因高脂摄入过多导致机体产生营养性肥胖的动物模型,并灌胃不同剂量的紫甘薯花青素比较其预防肥胖效果。每周定时测量大鼠禁食6 h后的体重,通过试剂盒检测大鼠血清样品血糖(Glu)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)的含量,采用酶联免疫法检测瘦素(Leptin)含量。通过荧光定量PCR法(RT-PCR)检测下丘脑样品瘦素及其受体的m RNA表达,采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测瘦素及其下游蛋白的信号表达。【结果】分离鉴定出11种PSPC组分,其中10种为已知的矢车菊素和芍药素酰基化衍生物,峰1为新发现的1种化合物。制备的花青素样品中矢车菊素-3-葡萄糖苷含量为17.4%。体重指标直接表明高剂量花青素组预防肥胖效果最好,为(358.2±20.1)g,中剂量组其次,为(371.6±16.3)g;效果最差的为低剂量组,体重为(384.0±7.2)g。紫甘薯花青素各剂量组大鼠血糖、甘油三酯和总胆固醇的3项血生化指标均趋于正常水平,有效预防肥胖的发生。血清瘦素检测结果显示,高脂组比对照组多释放65.50%;低剂量、中剂量和高剂量紫甘薯花青素组血清瘦素含量分别为(3.13±0.05)、(2.84±0.12)和(2.64±0.06)ng·m L~(-1),与高脂组相比均显著下降。同时不同剂量紫甘薯花青素组下丘脑中瘦素及瘦素受体的m RNA表达均显著高于高脂组。而高剂量紫甘薯花青素组可以调节下丘脑中瘦素信号,从而降低下游腺苷酸活化蛋白激酶α(AMPKα)的磷酸化。【结论】高剂量紫甘薯花青素可以通过调节下丘脑中leptin/AMPKα信号通路有效抑制高脂诱导肥胖的形成。
关键词： 紫甘薯 花青素 高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱 肥胖 瘦素 腺苷酸活化蛋白激酶
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施氮量与行距互作对小麦群体质量的调控效应
《麦类作物学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：为了解施氮量与行距互作对小麦群体质量的调控效应,于2013-2014年在中国农业科学院中圃场试验田进行裂区试验,以强筋小麦济麦20和中筋小麦中麦8号为试验材料,设置三个施氮水平(150、210和270kg·hm-2)和两个行距水平(12和20cm),比较分析了不同施氮量和行距组合下旱茬强、中筋小麦群体茎蘖数、茎蘖成穗率、叶面积指数、干物质积累量及产量差异。结果表明,在行距一定的条件下,适当增加施氮量,济麦20和中麦8号生育后期群体茎蘖数和茎蘖成穗率均显著升高。两个小麦品种各生育时期叶面积指数均不同程度提升。随施氮量的增加,中麦8号干物质积累量显著增加,而济麦20生育后期干物质积累量显著下降。在210kg·hm-2施氮量下,增大行距后,济麦20和中麦8号各主要生育时期群体茎蘖数和叶面积指数均显著升高。在中高氮条件下,济麦20和中麦8号生育后期干物质积累量随行距的增大而增加。综合来看,旱茬条件下济麦20和中麦8号分别在210kg·hm-2施氮量、20cm行距和270kg·hm-2施氮量、20cm行距下能够获得较高的群体质量和产量。
陆地棉Bt抗虫基因类型鉴定与染色体定位
《江苏农业学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：为明确Bt抗虫棉种质系N099的抗虫性状遗传方式、抗虫基因类型以及抗虫基因插入染色体的位置,用N099为父本与非抗虫海岛棉海7124杂交,分析了F2分离世代遗传方式,结果表明该抗虫棉的抗虫性状呈简单的1对显性基因控制的质量遗传方式。进一步在Bt毒蛋白和DNA 2个层面对该抗虫基因类型进行鉴定,结果显示N099所含抗虫基因为双价Bt基因Cry1Ac+Cry2A。而后利用234对核心引物对F2代抗、感株组成的近等基因混池进行多态性筛选,发现其中1对多态性引物NAU2912与该Bt基因连锁。已知引物NAU2912位于棉花第26染色体上,通过对该引物上、下50.0 c M之间的其他引物进行多态性筛选,共获得16对引物与双价Bt基因相连锁,目的基因位于分子标记dc40260和cgr6702之间,其遗传距离分别为1.8 c M和2.9 c M,因此将双价Bt基因定位在棉花第26染色体上。
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种植密度对玉米光合特性和产量的影响
《作物杂志 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：采用大田试验,研究5个种植密度(6.00、6.75、7.50、8.25、9.00万株/hm~2)对玉米品种苏玉20、苏玉29和郑单958的光合特性和产量的影响,为品种的合理密植和高产栽培提供理论依据。结果表明,苏玉20、苏玉29和郑单958产量均随密度的增加呈先升后降趋势,株高、穗位和叶面积指数逐渐提高,而单株叶面积和净光合速率逐渐降低。3个品种均在7.50万株/hm~2条件下产量最高,分别为8 264kg/hm~2、8 792kg/hm~2和7 194kg/hm~2,在此种植密度条件下植株维持较高的叶面积和光合速率是取得高产的重要原因。本试验中,苏玉20和苏玉29产量均高于郑单958,这可能与郑单958不适宜在江苏中南部地区夏播种植有关。
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解淀粉芽孢杆菌B1619脂肽类抗生素的分离鉴定及其对番茄枯萎病菌的抑制作用
《中国农业科学 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：【目的】从解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)生防菌株B1619发酵液上清中分离脂肽类抗生素,分析其抑菌活性相关成分,为应用解淀粉芽孢杆菌B1619菌株防控番茄枯萎病提供依据。【方法】利用特异性引物对B1619中3种脂肽类抗生素合成相关基因sfp、ituA和fenB进行检测;通过盐酸沉淀、甲醇抽提法等方法提取脂肽类抗生素粗提物;用Supelclean~(TM) LC~(-1)8柱及PHASE HF-NH2柱对3种脂肽类抗生素粗提物进行分离;通过MALDI-TOF-MS和HPLC分析、鉴定3种脂肽类抗生素;采用平板对峙培养分别测定3种脂肽类抗生素粗提物对番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的抑菌活性。【结果】从解淀粉芽孢杆菌B1619的基因组DNA中扩增sfp、ituA和fenB等脂肽类抗生素合成基因,扩增产物经克隆、测序分析,表明B1619菌株中含有这3个基因。通过HPLC分析,发现60%甲醇洗脱液分离物分别在12、16.5、18 min处出现相应峰值,保留时间与bacillomycin L标准品一致,分泌量为18.5 mg·L~(-1);70%甲醇洗脱液分离物分别在22、34、37、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与fengycins标准品一致,分泌量为5.1 mg·L~(-1);100%甲醇洗脱液分离物分别在27、37、41、51及53 min处出现相应峰值,保留时间与surfactins标准品一致,分泌量为74.3 mg·L~(-1)。经液质联用进一步验证分析3种脂肽类抗生素的质子化峰值,60%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 043.4、1 057.5和1 071.4 Da,是C13—C15的bacillomycin L;70%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 463.9、1 477.9、1 491.9和1 505.9Da,是C15—C17的fengycins;100%甲醇洗脱液分离物峰值范围在m/z=1 008.6、1 022.7和1 036.7 Da,是C13—C15的surfactins。平板对峙法试验结果表明1 mg·m L~(-1) bacillomycin L和fengycins对番茄枯萎病菌有较强的抑菌效果,而1 mg·m L~(-1)surfactins对番茄枯萎病菌的抑菌活性较弱,再将surfactins的浓度提高至3和6 mg·m L~(-1),发现其抑菌效果没有明显变化。【结论】B1619菌株分泌3种脂肽类抗生素,其中对番茄枯萎病菌生长起重要抑制作用的抗生素是bacillomycin L和fengycins,surfactins对番茄枯萎病菌的抑制活性较弱。
关键词： 解淀粉芽孢杆菌B1619 脂肽类抗生素 抑菌活性 番茄枯萎病菌
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水稻干尖线虫海藻糖酶Ab-tre-1基因克隆与逆境条件下的表达分析
《核农学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：海藻糖酶参与生物体内能量代谢,在抵御逆境胁迫过程中发挥关键作用。水稻干尖线虫是水稻上重要的寄生线虫,能够在多种逆境中存活,严重危害水稻生长。为探究水稻干尖线虫海藻糖酶基因的功能,利用RACE-PCR技术获得了该线虫海藻糖酶基因全长,将其命名为Ab-tre-1,并利用实时荧光定量PCR技术分析在线虫卵、不同龄期和若干逆境条件下该基因的表达情况。结果表明,该基因DNA序列长2 083bp,包含9个内含子,开放阅读框1 743 bp,编码580个氨基酸,含有2个典型的海藻糖酶标签基序。进化树结果表明,水稻干尖线虫海藻糖酶与自由生活线虫和动物寄生线虫位于不同进化分支。Ab-tre-1在线虫卵中的表达最高,二龄幼虫和成虫次之,三、四龄幼虫表达水平较低。此外,当水稻干尖线虫暴露于干燥、活性氧、高温和药剂胁迫环境中,Ab-tre-1表达水平均显著提高,表明该基因可能与水稻干尖线虫的抗逆过程有关。本研究结果为阐明水稻干尖线虫海藻糖酶基因抗逆表达提供了理论依据。
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小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟
《中国农业科学 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热点残基预测发现Cry1Ac毒素和mALP中分别有3个氨基酸残基(376ASN、443SER和486SER)和4个氨基酸残基(452ARG、499THR、502TYR和513TYR)是参与互作的关键氨基酸位点。【结论】经原核表达的小菜蛾mALP同样具有与Cry1Ac毒素结合的能力,并利用分子模拟技术预测了小菜蛾mALP三维结构及与Cry1Ac毒素结合模式。
关键词： 碱性磷酸酯酶 原核表达 配体印迹 同源建模 分子对接 热点残基预测
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茶树硝态氮转运蛋白NRT1.1基因的克隆及表达分析
《茶叶科学 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：以茶树(Camellia sinensis(L.))品种龙井43为试材,采用PCR结合RACE技术,克隆得到硝态氮转运蛋白基因(NRT1.1)的c DNA全长序列,基因序列全长1 880 bp,其中开放阅读框(ORF)1 788 bp,编码595个氨基酸,预测蛋白质分子量为65.9 k D,理论等电点为8.99,命名为Cs NRT1.1。序列分析表明,Cs NRT1.1与葡萄NRT1.1氨基酸序列的相似性最高。通过生物信息学分析,对Cs NRT1.1的氨基酸理化性质、亲/疏水性、跨膜区域及亚细胞定位进行了预测。实时定量PCR表达分析表明,茶树根和叶片中Cs NRT1.1在1 mol·L~(-1) NO3-处理5 min内均受到抑制,叶部Cs NRT1.1表达量0.5 h后即达到最大值,24 h内各个时间点均高于根部,根中表达量Cs NRT1.1始终低于对照。本研究结果为研究茶树对NO3-的吸收、转运和调控机理提供了分子生物学基础。
