科研产出
牛乳β-酪蛋自检测的ELISA方法
《山东农业大学学报 》 1999 北大核心 CSCD
摘要：体外乳腺细胞培养是整体泌乳研究的有效补充，也在乳腺生物反应器的研究中发挥着重要作用。但乳腺细胞分离培养成功的标志不仅仅是细胞的形态特征及增殖特性，更重要的是细胞的生理功能及分化状态。卜酪蛋白为乳中所特有的蛋白质，其在乳中的含量仅次于ａ一马酪蛋白居第二位，故可用这种蛋白做为乳腺细胞分化功能的指标。（①闷ｐ出ｌｉｎｋａｌ;;ｍｌｎ～ｍｐ）方法是以胡作为标记物或指示剂，进行抗原或抗体的检测。与放射免疫法比较。具有所需仪器设备简单、试剂价廉、无放射性危害等优点。９－＄蛋白的ＥＩＪＳＡ检测国内未见文献报道，国外多用Ｗ一印迹法［’，‘］，但Ｗｅｓｔｅｒｎ杂交更适于少量样品的定性检测，用于大量检测细胞培养物则显得很不方便，而Ｅ［ＪＳＡ方法一次可以方便地检测几十甚至几百个样品。ＥＬＩＳＡ方法中所用的酶有辣根过氧化物物酶（ＨＨＰ）、碱性磷酸酶、卜半乳糖茶酶等。由于ＩＩＲＰ活性强，价廉且性质稳定，故在ＥＩＪＳＡ中使用最广。本实验采用过碘酸盐改良法以ＨＲＰ标记抗体，建立了用ＥＩＪＳＡ夹心法检测牛卜酪蛋白的方法。豆材料与方法１．ｌ动物３只２月龄２．５－３ｋｇ雄性健康新西兰种兔。１．２试剂牛ｐ一酪蛋白（含量ｏｐ％以上），邻苯二胺（ＯＰＤ）为Ｓｉｐｏ公司产品，ＨＲＰ为处山仰ｐＭａｎｎｈａｉｎ公司产品，福氏佐剂购自中国农业科学院兽药研究所。中范围蛋白分子量标准为ｋ瓜湖公司产品。１．３兔抗个卜酷蛋白血清的制备及效价检取２你一ｍｌ的牛卜酪蛋白６ａｌｌ与６ｍｌ完全福氏佐剂混合，用两注射器相对反复抽送直至混合液完全乳化。给３只兔进行免疫注射，初次免疫选Ｍ后肢脚掌部各注射０．ｓｎｄ，背部４点每点０．ＳＩｎｌ。以后每隔１０ｄ加强免疫１次，加强免疫利用福氏不完全性剂和抗原的乳化物，每只兔每次注射的抗原量大约有４ｍｐ，第一次加强免疫经两后肢大腿肌肉内注射，第二次为皮下多点注射，第三次采用静脉及腹腔注射，第四次以后均采用耳缘静脉注射。在加强免疫期间用琼脂双扩散法检测抗血清效价。当达满意效价时，经兔颈动脉放血，分离血清，分装保存于一２０℃冰箱。１．４兔抗个ｐ一酸蛋白抗体的提取和鉴定采用饱和硫酸按沉淀粗提以．之后利用ＳｅＰｈａｄｅｘＧ－２５脱盐，ＤＥＡＥ纤维素纯化Ｄ］。１．５＄标兔抗牛ｐ一酷蛋白抗体的制备及纯抗体的ＨＲＰ标记采用过碘酸盐改良法［‘］。１．６ＥＩＪＳＡ夹心法检测井ｐ一酪蛋白（１）包被抗体：将兔抗牛ｐ一酪蛋白抗体用包被液稀释后，包被％孔酶标板，ＩＱ：）ｔ’Ｊ．孔，４℃过夜。（２）加标准产一酪蛋白（或样品），１００Ｗ孔，刃℃温育Ｉ．５一地。（３）加酶标抗体，１００ＷｆＬ，Ｐｔ温育互．５、Ｚｈ。（４）加显色液５０ｎｄＬ，室温进光显色２０ｏｈ。（５）加终止液那部Ｌ。（ｓｏ）用酶联免疫检测仪测ｏｎ值（４ｓｏ＿）。２结果与讨论２．ｌ兔抗牛卜酯蛋自抗血清的制备３只兔经免疫注射。均产生了抗月一田蛋白抗体。但其中２号免在加强免疫过程中死亡，可能是由于免疫应急或免疫注射液中微粒阻塞血管引起。１号兔经８次加强免疫产生了效价较高的抗血清，琼脂双扩散法测定效价达ｌ：３２。２．２免抗个具一酪蛋白抗体的制备纯化兔抗牛卜酪蛋白经脱盐和去除杂蛋白得以纯化，提纯Ｉｇｈ的分子量大约为１５（）ＫＩ）图１），抗体在最后稀释液中的浓度为２．１６ｍｇ／ｇｈ。２．３ＢｌｌＳＡｋ心法检测牛ｐ一酪蛋白的条件通过实验确定包被抗体浓度为１０ｎｄａｌｌ，ＨＲＰ标记抗体可采用ｇｕ倍稀释。对产一酪蛋白检测的灵敏度为Ｉ０ｎｐｅ，图２为检测ｐ一酪蛋白的标准曲线。实验发现，检测液中的血清成份对测定的结果影响很大，这可能与免疫家兔时抗原中含其他蛋白成分有关，这些微量的蛋白成分极有可能来自牛血清，在卜酪蛋白提纯过程中不易将这些杂蛋白完全去除。所以在乳腺细胞的诱导液中不易添加胎牛血清，以免影响测定结果。个乳腺细胞培养液中的酪蛋白浓度一般是在图２的测定范围之内的。如牛乳腺细胞系ＭＡＣ－Ｔ表达卜酪蛋白的量可达０．ｌ－０．３ｎｄｌ’ｌｌｒｍ沪］，原代培养乳腺细胞（ｌｏ－ｌ炉细胞）酪蛋白的表达量在０－２５（）ｎｄｌｎ培养液／ｄ［’ｊ。牛乳β-酪蛋自检测的ELISA方法@李震$上海农科院畜牧兽医研究所@陈永福$中国农业大学农业生物技术国家重点实验室!北京１０００９４牛乳β－酪蛋白;;ＥＬＩＳＡ1 Zavizion . B et al Subcloning the MAC-T bovine mammary 3epithclial cell line: morphology, growht properties, and cytogeneticanalysis of clonal cells .J. Dairy Sci, 1995, 78: 515-527 2 Wuynh, H.T, Robitaille, G and Tumer J. D Establishment of bovine mammary pithelial cells (MAC-T): An in vitro model forbovine lactation. Exp. Cell Res,1991, 187: 191-199 3周顺伍等.生物化学实验技术.北京农业大学出版社.1991 4免疫组织化学讲习班讲义.北京农业大学兽医学解剖组胚教研组,1984(未发表材料) 5 Talhouk, R. S, Neiswander, R. L.Schanbacher, F. L, In vitro culture of cryopreserved bovine mamary cells on collagengels, synthesis and lactoferrin. Tissue and cell ,1990, 22(5):583-599
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特种稻杂种优势利用
《上海农业学报 》 1999 CSCD
摘要：对“香型 Ａ／香型恢”配组成的杂交粳稻的香味鉴定表明，双亲均为香型的 Ｆ１ 代稻米具香味，不分离；双亲中仅一方为香型的 Ｆ１ 籽粒中香与非香呈１∶３ 分离，此种自然分离的微香型组合更适于平时食用。８ 个香型杂交粳稻组合平均比对照“９１１７”增产２０．５５％ ，其中“寒丰 Ａ／香恢１ 号”增幅达到２６．４０％ ，证明杂交香粳稻的产量优势明显。
关键词： 香粳稻;微香型组合;杂种优势利用
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Hsp菌剂在牛粪堆肥中的试验应用
《农业环境保护 》 1999 北大核心 CSCD
摘要：报道了Ｈｓｐ菌剂对牛粪堆肥发酵影响的初步试验效果。结果表明，Ｈｓｐ菌剂能迅速提高发酵温度，加快熟化进程，有效杀灭粪中所含的杂草种子和虫卵病菌，具有快速堆肥熟化和无害化的功效。
关键词： Hsp菌剂,牛粪,高温堆肥
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利用农业有机废弃物提高化学氮肥利用率的研究 Ⅱ.施用农业有机废弃物对化肥氮素利用率的影响
《上海农业学报 》 1999 CSCD
摘要：利用(１５)Ｎ示踪技术研究田间条件下施用农业有机废弃物鸡粪和稻草对化肥氮素利用率的影响。结果表明，施基肥时伴施这二种废弃物能提高作物对化学氮肥的利用率，当季小麦的化肥Ｎ利用率提高２５．５９％（稻草），土壤中残留的化肥Ｎ平均增加３８．１３％。后茬蕹菜的化肥Ｎ利用率提高２２．９６％（稻草）和４８．６６％（鸡粪）。土壤有机Ｎ分级结果表明，残留的化肥Ｎ主要以易被作物利用的酰胺态和氨基己糖态形式存在。
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猪流行性腹泻病毒的分离培养与鉴定
《上海农业学报 》 1999 CSCD
摘要：上海市农业科学院畜牧兽医研究所在上海郊区分离到一株猪流行性腹泻病毒（PEDV）。以人工攻毒发病猪的小肠粘膜无菌处理后接种已长成单层的VERO（非洲绿猴肾）传代细胞，并在维持液中加入胰酶50μg／mL和2％的小牛血清。盲传第4代时，于接种后的第3天出现致细胞病变作用（CPE）。自第8代开始，CPE于接种后16h开始出现，以后就一直有规律地稳定出现。CPE的主要表现为细胞的折光度降低、细胞圆缩、颗粒变性、细胞融合而形成多核巨细胞。至40～48h，CPE明显，细胞部分脱落，收获。同时，将人工攻毒发病猪的小肠粘膜无菌处理后的病毒与经胰酶消化分散的VERO一起培养。并在生长液中加入胰酶50μg／mL，3～4d长成单层。如此经盲传若干代，可用荧光抗体检测到在细胞浆内有特异性的荧光颗粒出现。目前，该带毒的VERO细胞已传至102代。
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上海市蔬菜品种资源研究(五)──几种易混淆蔬菜的识别(待续)
《上海农业学报 》 1999 CSCD
摘要：上海市栽培蔬菜种类繁多，有些蔬菜品种因其植物学性状近似，常常被人们混淆。本文通过分类对比、来源考证，对其加以区别。茴香与莳萝是伞形花科不同属的两种蔬菜作物，两者的果实形状明显不同。茴香的果实较瘦长，稍弯曲；莳萝的果实扁平，侧棱延展成翅状；蜂斗菜与款冬则是菊科不同属的两种植物。作为蔬菜栽培的蜂斗菜原产日本，上海于30年代引进种植。而款冬是中国传统中药材。在日本“款冬”却被误用于“蜂斗菜”。中国版的各类《日汉词典》中也将“蜂斗菜”错译为“款冬”。我国出版的一些有关蔬菜的书籍中，将蜂斗菜与款冬相混淆。笔者认为这一谬误应予认真纠正。
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