科研产出
非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立
《中国农业科学 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：[背景]非洲猪瘟(ASF)于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重.目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段.[目的]制备非洲猪瘟病毒(ASFV)特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法.为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段.[方法]构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验(iELISA)鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法.[结果]通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD.纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1:1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1:102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性.经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验(IFA)检测获得的8株单抗均具有良好的反应性.叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187-194aa.利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了 ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了 190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%.[结论]本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187-194aa.并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑.
关键词： 非洲猪瘟病毒 P30蛋白 单克隆抗体 抗原表位 阻断ELISA
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2种鹅星状病毒一步法双重RT-PCR检测方法的建立与应用
《江苏农业学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：为建立能同时快速鉴别新型鹅星状病毒和鹅星状病毒变异株的检测方法，根据新型鹅星状病毒的ORF2基因和鹅星状病毒变异株的ORF1a基因的保守区域序列，设计并合成2对特异性引物。通过优化反应体系及反应条件，建立了能同时检测2种鹅星状病毒的一步法双重RT-PCR检测方法。该方法可同时扩增出新型鹅星状病毒658 bp和鹅星状病毒变异株381 bp的特异性条带，对坦布苏病毒、鹅细小病毒、鹅副黏病毒、H9N2亚型禽流感病毒、大肠杆菌和沙门菌的扩增结果均为阴性，具有良好的特异性。对新型鹅星状病毒和鹅星状病毒变异株重组质粒的最低检测量分别是1μl 1.71×10~3拷贝和1μl 1.70×10~3拷贝，敏感性良好，并且具有良好的重复性。应用该方法对临床采集的雏鹅泄殖腔拭子进行检测，结果显示，124份样品中新型鹅星状病毒阳性率为45.16%,鹅星状病毒变异株阳性率为28.23%,2种鹅星状病毒均为阳性的占11.29%,与单一RT-PCR方法检测结果符合率为100.00%。本研究建立的一步法双重RT-PCR检测方法快速简便，特异性强、灵敏度高，可用于临床样品的鉴别诊断，该方法的建立对2种鹅星状病毒病的流行病学调查和有效防控以及混合感染的致病性研究具有重要意义。
关键词： 新型鹅星状病毒 鹅星状病毒变异株 一步法双重RT-PCR
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樟树加工剩余物育苗容器对黄瓜幼苗生长及生理特征的影响
《中国农学通报 》 2022 CSCD
摘要：为明确以樟树加工剩余物为原料制备的育苗容器对黄瓜幼苗生长及生理特征的影响,通过分析3种不同原材料制备育苗容器[未提取精油加工剩余物(TF-A)、提取精油后的加工剩余物(TF-B)和1:1共混物料(TF-C)]的理化特征、生物可降解性,测定育苗容器吸水特性变化与养分释放规律,以及对黄瓜种子发芽、幼苗生长生理指标及形貌结构的影响.结果表明,吸附平衡前,吸水率、吸水厚度膨胀率与浸渍时间呈线性相关(R2>0.8521),疏水性TF-A>TF-C>TF-B.育苗期间,容器总氮释放量最高达50.23%,总磷释放速率略低于总钾,有机碳矿化率差异不显著.与塑料容器(CK)相比,TF-B发芽率达74.81%,育苗容器发芽率最高达94%,无显著差异;TF-C茎基宽、叶绿素、地上鲜重、地下鲜重、地上干重和地下干重分别提高4.59%、12.18%、3.01%、6.80%、2.86%和15.79%,壮苗指数提高23.64%.总体上,樟树加工剩余物育苗容器对黄瓜幼苗生长表现出良好的育苗特性,与塑料容器育苗无显著差异.研究表明,以樟树加工剩余物作为基质载体在苗床育苗中具有较好的应用潜力,拓展了其剩余物资源高值加工利用途径.
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江苏省小麦参试品种(系)产量与产量构成因素分析
《中国农学通报 》 2022 CSCD
摘要：旨在明确江苏淮南和淮北麦区小麦产量构成因素对产量影响的相对重要性,采用相关和通径分析法,对江苏省2019-2020年度预备试验101个小麦品种(系)的产量及其构成因素进行分析.结果 表明,淮南和淮北小麦品种(系)的平均产量分别为7739.1 kg/hm2和8560.3 kg/hm2.相关分析表明,淮南小麦产量构成因素与产量均呈正相关,其中千粒重与产量呈极显著正相关;淮北小麦穗数与产量呈极显著正相关,穗粒数与产量呈显著负相关,千粒重与产量呈不显著正相关.偏相关分析表明,产量三因素与产量均呈极显著正相关,而三因素间均呈极显著负相关.通径分析表明,淮南以千粒重对产量的作用最大,淮北以穗数对产量的贡献最大.淮南小麦高产育种策略应重视稳重型品种选择,而淮北则应加强多穗型品种选择.
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江苏省域草莓灰霉病菌种群多药剂抗性检测
《中国农学通报 》 2022 CSCD
摘要：本研究旨在阐明江苏省草莓主产区草莓灰霉病菌种群对常用杀菌剂的敏感性.采用区分剂量法测定了 2019和2020年采集的236株草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)对13种杀菌剂的抗性,并对菌株抗性频率和多药剂抗性进行了分析.结果表明:所有灰霉菌株对咯菌腈(fludioxonil,Flu)表现敏感,而对多菌灵(carbendazim,Car)、吡唑醚菌酯(pyraclostrobin,Pyra)、扑海因(iprodione,Ipr)、腐霉利(procymidone,Pro)、嘧霉胺(pyrimethanil,Pyr)产生了较高的抗药性,其抗性频率分别为58.05%、55.01%、51.44%、45.80%、33.94%;灰霉病菌种群在地区间对不同药剂的抗药性水平不同,溧水、昆山、姜堰、铜山田间以抗性菌株为优势种群,无锡和常州新北地区以敏感菌株为主;本研究在区分计量浓度下,根据各药剂抑菌率分布状况,将供试药剂分为敏感药剂、敏感性下降药剂和抗性药剂3种类型;本研究共检测到9种抗药性类型:PyraR(7.32%)、CarR(6.50%)、PyrR(0.81%)、CarR PyrR(3.25%)、CarRPyraR(14.63%)、CarRBosR(1.63%)、CarRPyraRPyrR(23.58%)、CarRBosRPyraR(7.31%)、CarRBosRPyraRPyrR(34.15%).江苏省草莓灰霉病菌种群对多菌灵和吡唑醚菌酯基本丧失了敏感性,对扑海因、腐霉利、啶酰菌胺、戊唑醇等敏感性下降,多药剂抗药性种群以CarRPyraRPyrR和CarRBosRPyraR PyrR为主,抗性治理措施中推荐使用不同类型药剂交替防治灰霉病.
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光照和湿度对西兰花硫苷代谢及生物活性物质的影响
《食品与发酵工业 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：为探索可有效提升鲜切西兰花生物活性成分的光照及湿度条件,首先在超市货架低温[(13±1)℃]条件下,研究了不同光照[光密度5~8、25~35、75~85μmol/(m2.s)]联合不同湿度(50% ~60%、70% ~80%、90% ~100%)条件对鲜切西兰花的保鲜效果.通过分析表型、感官评分、色泽、总硫代葡萄糖苷(硫苷)和总异硫氰酸酯(isothiocyanate,ITC)的含量,筛选出光密度25~35μmol/(m2.s)协同湿度70% ~80%条件可有效提升西兰花品质.然后,以此条件处理鲜切西兰花,以超市实际销售环境[光密度:5~8μmol/(m2.s);湿度:50% ~60%]为对照组,研究光照和湿度对西兰花硫苷代谢及生物活性物质的影响.结果表明,光密度25~35μmol/(m2.s)协同湿度70% ~80%条件可有效保持鲜切西兰花中主要的硫苷物质含量,同时保持较高的黑芥子酶活性和ITC含量;此外,该条件下的西兰花花球中总酚、花色苷、叶绿素及类胡萝卜素含量较高.因此,光密度25~35μmol/(m2.s)协同湿度70% ~80%条件可有效保持鲜切西兰花品质,并维持其组织硫苷等生物活性物质含量,为其贮藏和销售提供理论及技术支持.
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灰飞虱脂肪酶LsLPS的原核表达及Ni-NTA纯化
《江苏农业学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：灰飞虱是危害中国水稻的3种主要稻飞虱之一.脂肪酶是脂肪代谢的关键酶,在昆虫发育、繁殖等生理活动中具有重要作用.为了深入研究脂肪酶(LsLPS)在灰飞虱生长发育中的功能,本研究克隆了LsLPS基因ORF序列,并进行了原核表达和His标签融合蛋白的纯化.结果显示,灰飞虱LsLPS开放阅读框长1293 bp,可翻译成430个氨基酸,含有信号肽序列和PF00151结构域.LsLPS连接到原核表达载体pET28a(+)-SUMO、pCold I后在表达菌株BL21(DE3)中主要以包涵体形式表达,连接到pET43.1a(+)后可在表达菌株BL21(DE3)中可溶性表达.采用pH 8.0、含20 mmol/L咪唑的磷酸缓冲液作为平衡液,Ni-NTA纯化LsLPS-pET43.1a(+)融合蛋白的纯度和产量相对较高.
关键词： 灰飞虱 脂肪酶 LsLPS基因 原核表达 Ni-NTA纯化
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基于PLC和云平台的鹅孵化机监控系统设计与试验
《华南农业大学学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：[目的]为了提高鹅种蛋孵化性能,针对现有鹅孵化机孵化过程自动化程度低、温度波动大、鲁棒性差,现场操作复杂等不足,设计了一种基于可编程逻辑控制器(Programmable logic controller,PLC)和云平台的鹅孵化机监控系统.[方法]根据鹅种蛋孵化工艺要求和鹅孵化机工作原理,采用PLC作为主控制器设计了系统的硬件电路和软件程序,实现孵化机温度、湿度、翻蛋和喷水晾蛋的自动控制,利用触摸屏和组态软件设计了孵化机现场监控的人机交互界面,并利用通用分组无线业务(General packet radio service,GPRS)智能网关、云平台服务器和移动端设计了远程监控系统.系统工作时,GPRS智能网关读取PLC中的存储数据,通过4G/5G网将数据上传至云平台服务器,移动端通过微信公众号、APP或网页可以直接访问和下载云平台服务器中的数据,并以图表形式显示出来.[结果]该监控系统运行稳定、状态良好;孵化过程中的温度采样数据鲁棒性高,100%达到控制要求;自动控制有助于提高鹅孵化机自动化水平;孵化生产试验结果表明,狮头鹅受精蛋平均孵化率为87.84%,比现有记载最高纪录高1.44%.[结论]该系统能够满足鹅种蛋孵化要求,且控制精度高,实现了鹅孵化机的自动控制、现场监控和远程监控,具有良好的人机交互界面,对促进农业装备自动化和信息化发展具有指导意义.
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小麦赤霉病菌对叶菌唑的抗性风险分析
《农药学学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：采用菌丝生长速率法,测定了2012–2014年采自我国江苏、安徽、山东和河南4个省份的100株小麦赤霉病菌对叶菌唑的敏感性,并通过室内药剂驯化获得叶菌唑抗性突变体,研究了抗性突变体的适合度及CYP51基因序列和表达量.结果表明:叶菌唑对供试菌株的EC50值范围为0.04~0.51μg/mL,平均EC50值为(0.18±0.09)μg/mL,供试菌株对叶菌唑的敏感性频率分布呈近似正态的连续性单峰曲线,尚未出现抗药性亚群体,可将该平均EC50值作为敏感性基线的参考值,用于监测田间抗药性的演化.通过室内药剂驯化共获得12株抗性突变体,其中2株表现为中等水平抗性,抗性倍数(RI)分别为14.2和15.8,10株表现为低水平抗性,RI值为3.25~9.05.与亲本菌株相比,部分抗性突变体的菌丝生长速率及分生孢子产生能力均显著降低,所有抗性突变体对小麦的致病力均显著降低.交互抗性研究表明,部分抗性突变体对戊唑醇、丙环唑及咪鲜胺表现为抗性,对丙硫菌唑和三唑酮未表现出抗性;部分抗性突变体仅对戊唑醇表现为抗性,对丙环唑、咪鲜胺、丙硫菌唑和三唑酮均未表现出抗性;所有抗性突变体对氰烯菌酯均表现为敏感.研究表明,小麦赤霉病菌对叶菌唑存在低等抗性风险.与亲本菌株相比,2株中等水平和2株低水平抗性突变体的CYP51基因及启动子序列均未发生突变;4株抗性突变体的CYP51A基因表达量均上调,上调倍数范围为1.33~10.28,推测CYP51A基因表达量上调可能与小麦赤霉病菌对叶菌唑抗性的产生相关.
关键词： 小麦赤霉病菌;叶菌唑;抗药性机制;交互抗性;抗性风险;基因突变;CYP51基因
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次氯酸钠处理种子对芹菜幼苗可溶性糖含量及相关基因表达的影响
《植物生理学报 》 2022 北大核心 CSCD
摘要：种皮革质化、透水性差的特点导致芹菜种子发芽慢、发芽不整齐。次氯酸钠溶液作为消毒剂可以促进种子萌发,但次氯酸钠处理种子对芹菜幼苗的影响尚不清楚。本文探讨了不同浓度次氯酸钠溶液浸种对芹菜3个生长阶段(播种后20、40、60 d)幼苗可溶性糖含量的影响,并结合RT-qPCR技术分析了与可溶性糖代谢通路相关基因表达情况(蔗糖合成酶基因SS、蔗糖磷酸合成酶基因SPS、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因UGPase、蔗糖磷酸磷酸酶基因SPP、转化酶基因Ivr)。研究发现5%的次氯酸钠溶液浸种可提高芹菜幼苗叶片可溶性糖含量且效果最佳,其中‘六合黄心芹’和‘赛雪’芹菜幼苗叶片在播种后60 d的含糖量分别为13.20和14.00 mg·g-1 (FW);此外,两个品种三个生长阶段的可溶性糖合成相关基因SS和SPS的相对表达量均在5%次氯酸钠浸种最高。结果表明5%次氯酸钠溶液浸泡芹菜种子是提高幼苗可溶性糖含量的适合浓度,可为提高芹菜产量提供理论依据。
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