CRISPR/Cas9新型基因打靶系统的研究进展

李辉; 施振旦; 《江苏农业学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：CRISPR/Cas9系统是细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源DNA入侵的免疫机制之一。在菌体内,CRISPR簇在其前导区的调控下转录成precrRNA,在tracrRNA和Cas9参与下加工成成熟的crRNA,并引导crRNA/tracrRNA/Cas9复合体识别结合外源DNA特定序列,剪切DNA双链,沉默外源基因的表达。基于此种原理,CRISPR/Cas9系统被开发成一种新型的基因打靶系统。相对于稍早的RNAi、Cre/LoxP、ZFN和TALEN系统,此新型打靶系统具有操作简单、效率高、成本低、可同时沉默任意数量的基因等优点。本文着重对CRISPR/Cas9打靶系统的结构、工作原理及目前的应用进行综述,并对该系统在未来生命科学研究以及临床中的应用进行了展望。

关键词： CRISPR/Cas9 基因打靶 crRNA tracrRNA

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陆地棉水通道蛋白GhNIP6.1基因的克隆及表达分析

巩元勇; 郭书巧; 束红梅; 倪万潮; 《棉花学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：根据EST拼接的序列设计引物,利用RT-PCR技术,从陆地棉品种苏棉18中克隆获得了一个水通道蛋白基因GhNIP6.1。该基因开放阅读框包含903个核苷酸,编码300个氨基酸,分子量为30.97kD,理论等电点为8.99。GhNIP6.1蛋白的生物信息学分析表明:GhNIP6.1含有6个跨膜区,由5个环相连,其中环A、C和E在细胞膜外,环B、D和蛋白的N、C末端都位于细胞膜内,N末端79个氨基酸,C末端18个氨基酸,具有MIP家族典型的保守氨基酸序列;该蛋白的三级结构同拟南芥的AtNIP6.1非常相似,亚细胞定位也同AtNIP6.1一致,可能位于质膜中。进化分析发现,GhNIP6.1蛋白同拟南芥的AtNIP6.1蛋白相似性最高。进一步扩增棉花核基因组获得了2021bp的DNA序列,它包含5个外显子和4个内含子,所有外显子/内含子交接点都遵从gt/ag剪接规则。半定量分析表明,该基因在根、茎和叶中都有表达,其中真叶含量较高,子叶中没有表达。

关键词： 陆地棉 水通道蛋白 GhNIP6.1 表达序列标签

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~(60)Co γ射线辐照对聚乙烯薄膜降解性能的影响

李澧; 朱佳廷; 冯敏; 顾贵强; 杨萍; 王德宁; 《核农学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：本研究以聚乙烯薄膜为研究对象,60Co辐照装置为辐照源,辐照剂量分别为0、10、50、100kGy,60Co γ射线辐照对聚乙烯薄膜降解性能影响的研究结果表明,60Co γ射线辐照聚乙烯薄膜能有效的增加薄膜表面的亲水性,降低力学性能。当60Co γ射线辐照剂量达到100kGy时,聚乙烯薄膜表面出现大量裂纹,纯水接触角为44°,有利于微生物吸附。60Co γ射线辐照法是一种能够有效促进聚乙烯薄膜降解的方法。

关键词： 聚乙烯薄膜 辐照 降解 亲水

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油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R等位基因特异PCR标记的开发与应用

龙卫华; 高建芹; 付三雄; 陈锋; 周晓婴; 彭琦; 张维; 浦惠明; 戚存扣; 张洁夫; 陈松; 《作物学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：油菜抗咪唑啉酮类除草剂基因BnALS1R是从抗性突变体M9中克隆获得,抗性基因BnALS1R与野生型基因BnALS1存在1处SNP,即乙酰乳酸合酶第638位丝氨酸残基被天冬酰胺酸替代。为获得油菜抗除草剂基因BnALS1R的分子标记,根据该处点突变,结合获得的BnALS3与BnALS1序列,开发30条等位基因特异PCR(allele-specific PCR,AS-PCR)引物,采用筛选出的3条AS-PCR引物在F2、BC1和BC2群体中进行PCR扩增。结果表明,该标记有效检测出群体中存在的3种基因型,其分离比分别为1∶2∶1、1∶1、1∶1,均遵循单基因遗传规律。应用该标记对获得的抗性恢复系进行PCR扩增,结果发现所有抗性恢复系均能扩增出抗性基因BnALS1R目的条带,表明3条标记引物可应用于抗性基因的检测。AS-PCR标记的获得将促进以抗性基因进行油菜抗除草剂分子标记辅助选择育种。

关键词： 油菜 咪唑啉酮类除草剂 BnALS1R 乙酰乳酸合成酶 等位基因特异PCR

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猪链球菌2型对细胞粘附作用及粘附因子转录水平分析

汪伟; 何孔旺; 倪艳秀; 吕立新; 周俊明; 张雪寒; 《西南农业学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：本研究中主要采用粘附计数和目前已发表的粘附因子,通过检测它们mRNA相对转录水平,研究了SS2粘附PK-15细胞、HEp-2细胞及PIEC的能力。结果显示,总体强毒株对细胞的粘附能力较强,无毒株对细胞没有粘附能力,但这不是绝对的,并初步在mRNA水平上阐明SS2粘附细胞能力差异的原因。这为后续研究SS2粘附机制及了解SS2感染后的致病机理奠定基础。

关键词： 猪链球菌2型 粘附作用 粘附因子 细胞培养 荧光定量PCR

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猪肺炎支原体主要抗原蛋白的研究进展

张悦; 刘茂军; 邵国青; 《中国农学通报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)是引起猪支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae of Swine,MPS)的病原,给养猪业造成巨大的经济损失。由于对具有良好免疫原性的Mhp特异性蛋白缺少深入研究,使得Mhp在致病机制、血清学检测方法和新型疫苗的研究发展上受到一定限制,从而影响了对MPS的控制。本研究综合Mhp主要粘附因子、膜蛋白及细胞质蛋白等主要抗原蛋白的研究进展,为该病原致病机理研究、建立特异性诊断方法和推动基因工程疫苗发展提供一定的理论基础,对MPS的正确诊断、检测、免疫预防和控制也有重要意义。

关键词： 猪肺炎支原体 特异性抗原蛋白 特异性诊断方法 疫苗

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大豆花叶病毒诱导的应用于膜蛋白酵母双杂交的大豆cDNA文库构建

崔晓艳; 陈新; 栾鹤翔; 智海剑; 《植物病理学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：前言大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是大豆上最普遍的病害之一,严重影响大豆的产量和品质,通过筛选与病毒互作的寄主蛋白,根据互作蛋白的功能和两者的作用机制可揭示病毒侵染的分子机制。对于病毒编码的膜蛋白或者膜相关特性的蛋白,由于具有膜结合特性,在生物体内的互作多发生在膜上。传统的酵母双杂交系统发生在核内,试剂盒的载体上加了核定位信号

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堆肥预处理温度控制促进麦秸厌氧发酵产沼气

陈广银; 马慧娟; 常志州; 叶小梅; 杜静; 徐越定; 张建英; 《农业工程学报 》 2013 EI 北大核心 CSCD

摘要：为阐释温度在堆肥预处理影响秸秆厌氧发酵产沼气中的作用,以麦秸为原料,研究堆肥不同升温阶段麦秸的厌氧发酵产气特性,并以麦秸堆肥的温度数据为基础,以灭菌后的麦秸为原料进行模拟堆肥(不同温度处理),模拟堆肥后的麦秸进行厌氧发酵产沼气。结果表明,在堆温升至55℃前,麦秸干物质(TS)损失率为4.06%,当堆温升至55℃后麦秸TS损失率迅速增加,堆肥10 d后麦秸TS损失率达22.45%;堆肥后麦秸厌氧发酵产气速率并无明显提高,TS产气量随堆肥时间先增加后降低,以堆温升至55℃时麦秸TS产气量最大,为349.92 mL/g,较开始堆肥增加了7.56%,扣除堆肥造成麦秸有机物损失,堆肥预处理对麦秸产气量并无明显促进;当堆温超过55℃以上9 d的麦秸产气量仅为开始堆肥的66.58%。模拟堆肥的结果表明,不同温度处理对麦秸有机物损失、物质组成均有较大影响,模拟堆肥后麦秸半纤维素大幅降低了28.10%,TS产气量随处理温度、处理时间的增加先增加后降低,当处理温度为55℃时获得最大TS产气量,为342.36 mL/g,较未处理提高了8.35%;随着处理温度的提高和处理时间的延长,麦秸TS产气量逐渐降低。以上结果表明,堆肥预处理产生的高温对破坏秸秆物质结构、提高其厌氧生物转化性能有较大影响,当秸秆堆体温度升至55℃时应停止堆肥,进行厌氧发酵产沼气。该文可为堆肥预处理在秸秆沼气工程中应用提供参考。

关键词： 厌氧消化 沼气 温度 麦秸 堆肥预处理

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弓形虫重组MIC3蛋白间接ELISA检测方法的建立

白昀; 王海燕; 张悦; 姚景霆; 吴叙苏; 刘冬霞; 邵国青; 《中国兽医科学 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：为检测弓形虫特异性抗体,以纯化的重组MIC3蛋白作为包被抗原,用羊抗猪IgG-HRP作为酶标二抗,分别对抗原浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度以及作用时间等进行了优化,初步建立了检测弓形虫特异性抗体的间接ELISA方法。结果显示,该方法检测猪球虫、猪肺炎支原体、猪圆环病毒2型、副猪嗜血杆菌等阳性血清均为阴性,表明该方法具有良好的特异性。组内和组间重复性试验的变异系数均小于8%,表明该方法具有较好的重复性。应用所建立的ELISA方法和商品化试剂盒A(IHA)、B(ELISA)同时检测从南京某猪场采集的猪血清样品166份,符合率分别可达94.58%和95.78%。该方法为我国进行弓形虫病的诊断与流行病学调查提供了一种技术手段,并为试剂盒的研制与开发奠定了前期工作基础。

关键词： 刚地弓形虫 MIC3蛋白 酶联免疫吸附试验 抗体检测

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猪圆环病毒2型Rep蛋白基因的原核表达及间接ELISA抗体检测方法的建立

李文良; 毛立; 张纹纹; 王小敏; 茅爱华; 甘源; 江杰元; 《中国兽医学报 》 2013 北大核心 CSCD

摘要：采用PCR方法扩增猪圆环病毒2型(PCV-2)Rep蛋白基因,克隆入原核表达载体pET-32a(+),转化大肠杆菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE检测目的蛋白得到成功表达,采用His标签单抗和PCV-2阳性猪血清进行Western blot鉴定表明重组蛋白具有良好的抗原性。利用纯化的重组蛋白rRep作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。抗原最适包被质量浓度为1mg/L(0.1μg/孔),待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶3 000。用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清,结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别为<5%和<10%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用rRep-ELISA对113份血清样品进行检测,与rCap-ELISA结果比较,rRep-ELISA检测阳性率为50.44%(57/113),略低于后者的54.87%(62/113),2种方法检测符合率为88.5%(100/113),具有较好的一致性。这为PCV-2感染的流行病学调查和新型ELISA诊断试剂盒的研制奠定基础。

关键词： PCV-2 Rep蛋白 原核表达 ELISA

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