科研产出
基于磁珠和双抗夹心免疫分析的Bt Cry1Ac毒素单链抗体筛选与鉴定
《中国农业科学 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：【目的】通过设计并优化生物素-亲和素标记磁珠筛选策略,建立针对Cry1Ac毒素的新型双抗夹心ELISA检测方法,为研究灵敏、快速的Bt毒素的检测方法建立一种新的检测模式。【方法】采用磁珠液相正负筛选方法,经过4轮筛选后,对每轮筛选后抗Cry1Ac毒素特异性结合噬菌体抗体的富集效果进行鉴定,通过单克隆ELISA方法从第4轮筛选得到的次级库中获得特异性结合Cry1Ac的阳性克隆,并对其进行PCR鉴定和DNA测序,确定有完整插入的scFv片段后进行后期相关试验。将相对结合活性最好的阳性克隆scFv-A12替换宿主菌HB2151中进行可溶性诱导表达并纯化。利用纯化后的scFv-A12作为"捕获抗体",Anti-Cry1Ac兔多克隆抗体作为"检测抗体",建立针对Cry1Ac的双抗夹心ELISA检测方法。【结果】以生物素化的Cry1Ac蛋白为包被原,利用噬菌体抗体库对其进行了4轮液相筛选。结果显示,相对产出率随着筛选轮数的增加而提高,第4轮较第1轮提高了42倍;单克隆噬菌体ELISA鉴定抗Cry1Ac噬菌体抗体,以试验孔OD450/阴性孔OD450大于2.1为阳性标准,从第4轮筛选后的培养皿中随机挑选了300个菌落,经单克隆ELISA鉴定出6个阳性克隆,分别命名为hsCry1Ac-C5、hsCry1Ac-D8、hsCry1Ac-C12、hsCry1Ac-A12、hsCry1Ac-F9和hsCry1Ac-F4。其中,hsCry1Ac-A12具有相对较高的亲和力。对上述6个阳性克隆进行菌液PCR检测发现,在935 bp处均有明显的目的条带,通过对其进行测序和氨基酸序列比对,最终得到4株不同氨基酸序列的阳性克隆。hsCry1Ac-A12在成功替换宿主菌HB2151后,经1 mmol·L-1 IPTG诱导表达,于30℃条件下培养过夜。其表达产物经His Trap HP镍亲和柱纯化后SDS-PAGE检测,hsCry1Ac-A12蛋白分子量约为30 kD。通过方阵滴定对抗体浓度进行优化后,利用单链抗体为"捕获抗体",多抗为"检测抗体",建立了Cry1Ac双抗夹心ELISA检测方法。在1.25—2.43μg·mL-1线性检测范围内,线性回归方程为Y=0.2522X+1.2832(R2=0.9564),检测限为1.08 ng·mL-1。【结论】利用磁珠液相筛选方法,建立了针对Cry1Ac毒素的双抗夹心ELISA检测方法,为快速、准确检测转基因食品中Cry1Ac提供了一种新的检测模式。
关键词： 磁珠 Cry1Ac毒素 单链抗体 双抗夹心ELISA
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均匀设计法优化冬瓜膨化工艺
《核农学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为对冬瓜脆条真空微波联合气流膨化工艺进行优化,采用均匀设计法,考察预干燥后含水率、微波功率和时间、膨化温度、抽空干燥温度和时间6因素5水平对膨化率、脆度、亮度L*和终含水率的影响,并通过逐步回归法对数据进行分析。结果表明,最佳膨化工艺参数组合为:预干燥后含水率47.4%,微波功率8.5W·g-1,微波加热时间为135s,膨化温度为106℃,抽空干燥温度为72℃,抽空干燥时间为85min。研究结果可为真空微波联合气流膨化冬瓜脆条的工业化生产提供参考。
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生防菌sf628对梨叶片苯丙氨酸解氨酶和过氧化物酶活性的影响
《江苏农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为了从分子水平上探明生防菌抗病机制,采用化学分析方法测定生防菌sf628处理后梨叶片中苯丙氨酸解氨酶(PAL)和过氧化氢酶(CAT)的活性,并运用荧光定量PCR方法分析编码PAL和CAT基因在分子水平的表达情况。结果显示:生防菌sf628处理后,梨叶片PAL和CAT活性均显著增加,处理48 h后,PAL和CAT活性均达到最大值,比处理0 h分别提高2.44倍和4.05倍;基因PAL和CAT的表达量增加,处理24 h后,基因PAL和CAT表达量均达到最大值,分别为清水对照的2.44倍和3.51倍。说明PAL和CAT活性的变化在时间上不同步于相应基因的表达量,但两者的变化趋势一致。因此,喷施生防菌sf628可以在分子水平上调控梨叶片基因PAL和CAT的表达量,并使相应PAL和CAT活性增加,从而提高梨抗病性。
关键词： 梨 苯丙氨酸解氨酶 过氧化氢酶 基因表达 荧光定量PCR
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套式PCR检测中国江苏省猪场猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染(英文)
《中国人兽共患病学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：目的猪鼻支原体和猪肺炎支原体的感染在中国养猪业较为普遍,本研究对江苏省猪鼻支原体(Mycoplasma hyorhinis,Mhr)和猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)流行病学进行初步调查。方法从江苏省不同的猪场采集7、14、21、28及35日龄仔猪的鼻拭子样本,用套式PCR方法对收集的399份鼻拭子样本进行Mhr和Mhp的检测。结果江苏省不同猪场样本中Mhr的检出率为70.9%,Mhp检出率为13.5%。5周龄以下的猪Mhr的感染率要高于Mhp。其中30个样本(7.5%)的检测结果为两种病原体共感染。7-35日龄的猪Mhr的感染率随着日龄的增长呈现明显的上升趋势,但Mhp的感染率并未随着仔猪日龄的增长而显著上升。从本研究结果分析还发现,不同品种的猪Mhr的感染率存在显著差异,与其他品种猪相比姜曲海瘦肉型品种猪(Jiangquhai porcine lean strain,JQHPL)更易于感染Mhr(p<0.001),但是其Mhp的感染率与其他猪相比不存在显著性差异(P>0.05)。结论本试验调查了江苏地区猪场中仔猪感染Mhr和Mhp的情况,且研究结果表明Mhr的感染状况与日龄及品种有一定关系。
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不同水性及水包油型佐剂对猪支原体肺炎灭活疫苗的免疫增强作用
《畜牧兽医学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：旨在为猪支原体肺炎灭活疫苗研发水性的或水包油型佐剂,降低疫苗的副作用。利用小鼠为模型动物评价几种不同佐剂配合猪支原体肺炎灭活疫苗免疫动物时对细胞免疫和体液免疫应答的增强作用。将不同佐剂与灭活疫苗配合肌肉注射免疫小鼠,检测脾淋巴细胞对猪肺炎支原体抗原的增殖应答情况及特异性的血清IgG抗体水平。试验分两批次进行,共评价11种佐剂。结果表明,卡波姆974+免疫刺激复合物基质混合物佐剂和壳聚糖+左旋咪唑混合物佐剂强烈地诱导产生高水平细胞免疫和体液免疫应答(P<0.01);卡波姆974+左旋咪唑混合物佐剂、卡波姆974+左旋咪唑+黄芪多糖混合物佐剂和ISA 11R VG佐剂次之(P<0.05);β-葡聚糖+左旋咪唑混合物佐剂、DEAE-dextran+左旋咪唑+黄芪多糖混合物佐剂和β-葡聚糖+左旋咪唑+黄芪多糖混合物佐剂在细胞免疫应答方面作用显著(P<0.01),但体液免疫应答作用稍弱;而GEL 01ST佐剂在体液免疫应答方面作用显著(P<0.01),细胞免疫应答作用稍弱。通过分析认为卡波姆974+免疫刺激复合物基质混合物佐剂、壳聚糖+左旋咪唑混合物佐剂的效果最好,可同时显著增加细胞及体液免疫应答,本试验结果将为猪支原体肺炎灭活疫苗的佐剂研发提供数据基础。
关键词： 水性佐剂 水包油佐剂 猪支原体肺炎灭活疫苗 细胞免疫 体液免疫
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辣椒花青素生物合成相关基因的表达分析研究
《华北农学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：为了明确辣椒花青素生物合成途径中相关基因的表达调控模式,选取3种不同果实颜色的辣椒品系(紫晶、淡紫、水晶)为试材,提取果实不同发育阶段的RNA并反转录成cDNA,利用qRT-PCR技术分析相关基因(CHS、CHI、F3H、F3'5'H、DFR、ANS、UFGT、ANP、GST)在不同辣椒材料果实不同发育阶段的表达情况。结果显示:CHS、CHI在3种材料果实发育过程中表达量都很少且无规律可循,F3H在淡紫、紫晶中表达量较高,且在果实发育的第15~20天时出现较大峰值,与之相比在水晶中的表达量可以忽略不计。F3'5'H、ANP、GST、DFR、UFGT在3种材料中相对表达量随着果实的发育分别呈现同步变化,且F3'5'H、ANP、GST在材料紫晶果实发育的第15天相对表达量出现较大峰值,ANS在3种材料果实发育过程中的相对表达量变化没有一定规律可循。F3H、F3'5'H、ANP、GST是辣椒花青素代谢途径的关键基因。
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海岛棉的一个富含亮氨酸重复受体蛋白基因的克隆和功能分析
《江苏农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：通过染色体步移获得了海岛棉的一个受体蛋白基因Gb Vdr1,其开放阅读框为3 387个核苷酸,编码1 128个氨基酸,编码蛋白分子量为1.249×105,等电点为5.86。Gb Vdr1与陆地棉抗病材料常抗棉和感病材料渝棉1号中的同源基因Gh Vdr1和Gh Vdr1-1的相似度高达99.85%。Gbvdr1具有信号肽、跨膜区、LRR重复区、蛋白质降解相关的PEST结构域以及内吞信号。Gb Vdr1在根茎中的表达量高于叶片,其对非落叶型黄萎病菌株BP2的反应较落叶型菌株V991的更为强烈,并且这种差异在茎和根中更为明显。Gb Vdr1定位于细胞膜上。PCR鉴定共获得Gb Vdr1过表达转基因株系23株,对目的基因表达量最高的株系进行黄萎病抗性鉴定,结果表明转基因株系对BP2的抗性显著增强,但是对V991没有抗性。转基因株系接种黄萎病后防卫反应(PR)相关基因PR1、PR5、EDS1以及GST1的表达量较野生型显著增加。对于Gb Vdr1的功能分析结果表明其参与了棉花对BP2的抗性反应。
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TD70/Kasalath RIL群体定位水稻穗部主要性状的QTL
《西南农业学报 》 2014 北大核心 CSCD
摘要：利用穗部性状存在明显差异的粳稻TD70和籼稻品种Kasalath杂交,经单粒传法获得的240个重组自交系(RIL)为作图群体,分别于2010和2011年对穗长、每穗总粒数和着粒密度进行鉴定,用完备区间作图法,以均匀分布于12条染色体的141个SSR标记对粒型性状进行QTL检测。结果表明,共检测到3个性状的QTL 23个,其中控制穗长的5个QTL、每穗总粒数的8个QTL、着粒密度的10个QTL,分布在第2、3、4、6、7、8、9和10染色体上,LOD值范围为2.5~9.3,单个QTL的贡献率介于4.0%~20.8%之间。第2染色体的RM5699-RM424、第3染色体的RM489-RM1278、第4染色体的RM3367-RM1018和第6染色体的RM3343-RM412区间,都检测到同时影响每穗总粒数、着粒密度的QTL,2年均被检测到的QTL共有6个QTL,分别是控制穗长的qPL3、每穗总粒数的qTSP4、qTSP6-2、qTSP7、着粒密度的qGD3-2、qGD7。其中qPL3、qTSP6-2、qGD3-2和qGD7为主效QTL。除穗长性状5个位点均有报道外,其余2个性状中均发现新的位点,共有16个QTL可能是新的位点,单个QTL贡献率为4.0%~9.5%。本研究为进一步精细定位或克隆这些粒型QTL奠定了基础。
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