科研产出
抗猪瘟病毒中和性单克隆抗体的制备与鉴定
《河南农业科学 》 2019 北大核心
摘要：为了获得具有中和活性的抗猪瘟病毒(CSFV)单克隆抗体,分别将CSFV和杆状病毒表达系统表达纯化的CSFV E2蛋白与佐剂混合后免疫BABL/c小鼠,经杂交瘤细胞融合制备抗CSFV单克隆抗体,经过多轮亚克隆和免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)筛选,成功获得5D1、8H7、9A1和13B2共4株能够稳定分泌抗CSFV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。4株单克隆抗体轻链均属于κ型,其中5D1、8H7、13B2为IgG1亚型,9A1为IgG2c亚型。间接ELISA检测结果显示,4株单克隆抗体的腹水效价在2.56×10~5～1.02×10~6;IPMA效价分别为6.40×10~4、1.28×10~5、2.56×10~5、1.28×10~5;SDS-PAGE和Western blot检测结果显示,4株单克隆抗体均能与经原核表达系统及杆状病毒表达系统获得的CSFV E2蛋白发生特异性反应;IPMA检测结果显示,4株单克隆抗体均能与CSFV发生特异性反应,而与牛流行性腹泻病毒(BVDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒(PCV2)均无交叉反应。病毒中和试验证实,单克隆抗体13B2具有中和活性,其中和效价为1.28×10~4。综上,成功筛选出4株能够分泌抗CSFV特异性抗体的杂交瘤细胞株,其中单克隆抗体13B2具有中和CSFV感染活性。
关键词： 猪瘟病毒 E2蛋白 中和性单克隆抗体 抗体中和效价 免疫过氧化物酶单层细胞试验
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猪流感病毒NP蛋白单克隆抗体的制备与鉴定
《河南农业科学 》 2019 北大核心
摘要：为了制备猪流感病毒(SIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(MAb),采用差速离心法纯化H1N1和H3N2亚型SIV后交叉免疫BALB/c小鼠,利用淋巴细胞杂交瘤技术制备杂交瘤细胞,通过建立的免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)单克隆抗体检测方法进行筛选。获得3株能稳定分泌抗NP蛋白的杂交瘤细胞,分别命名为16D5、18G8和20C4,将它们诱导小鼠产生的腹水IPMA效价分别为1×10~(-6)、1×10~(-6)和1×10~(-5)。亚型鉴定结果显示,3株单克隆抗体的重链均为IgG1,轻链为κ链。3株单克隆抗体特异识别H1N1、H3N2、H5N1、H7N9和H9N2亚型流感病毒,并且与猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒和猪细小病毒无交叉反应。Western blot检测结果表明,3株杂交瘤细胞培养上清均在56 ku附近出现一条特异性的蛋白质条带,说明针对SIV的NP蛋白制备了3株单克隆抗体。综上,成功制备了针对SIV NP蛋白的3株单克隆抗体,可识别不同亚型的SIV。
关键词： 猪流感病毒 免疫过氧化物酶单层细胞试验 NP蛋白 单克隆抗体
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郑196耐大豆胞囊线虫病研究及耐病机理初探
《分子植物育种 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：郑196是从黄淮海大豆产区选育的优良大豆品种。该品种在SCN2病圃中鼓粒情况良好;2017年,郑196在黄淮海9个试点的产量与在SCN2病圃中产量相比较,差异不显著,说明该品种具有耐SCN病的特性;利用荧光定量PCR,进一步分析来自Rhg1/Rhg4位点的4个SCN-抗性基因(Glyma18g02580, Glyma18g02590, Glyma18g02610, SHMT)在郑196及其他不同抗性水平大豆中的表达,结果表明:在受到SCN2侵染的0～25 d,4个SCN-抗性基因在抗病材料中的表达量均持续提升;在受到SCN2侵染的10 d/15 d,这4个SCN-抗性基因在郑196及感病材料中表达量达到最高点,之后表达量下降,该结果表明,郑196的耐SCN病机理不同于SCN抗性基因在抗病材料中的抗病机理,其耐病性不是由SCN抗性基因单独调控的,有可能存在其特有的耐病通路或是由抗性基因与耐病基因共同调控其耐病机制。本研究可对抗SCN种质资源创新和抵御SCN策略提供参考依据。
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428份玉米自交系籽粒脱水速率的比较分析
《植物遗传资源学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：玉米籽粒的脱水速率是决定收获期籽粒含水量的关键因素。本研究同时在新乡原阳、商丘虞城和周口郸城调查428份玉米自交系在授粉后35～55 d不同时期的籽粒脱水速率及相关农艺性状。结果表明:428份自交系的籽粒脱水速率在三地均表现出丰富的遗传多样性,与穗轴含水量、苞叶含水量呈显著相关,与籽粒含水量呈极显著相关,与穗位高、株高、雄穗分枝数、抽雄期、吐丝期无显著相关,但与苞叶数及生理成熟期的相关性并不明确;在428份玉米自交系中,授粉后35～55 d籽粒脱水速率仅与授粉后35～40 d籽粒脱水速率(生理成熟期前)存在极显著相关,与50～55 d的籽粒脱水速率(生理成熟期后)无显著相关。这表明生理成熟期前的籽粒脱水速率对授粉后35～55 d籽粒脱水速率的影响更为显著。依据生育期、授粉后35～55 d籽粒脱水速率及授粉后55 d的籽粒含水量,共筛选出生育期不同、籽粒含水量低(低于25%)、籽粒脱水速率快(大于1%)的玉米自交系共计42份。
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猪miR-149靶基因预测及生物信息学分析
《河南农业科学 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：通过对猪miR-149进行靶基因预测及相关生物信息学分析,探索其影响猪颗粒细胞凋亡和卵泡闭锁的作用机制。首先利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测ssc-miR-149在氧化应激组和正常组表达量的变化,通过转染miR-149 mimic并利用MTT和qRT-PCR检测细胞活性和凋亡基因的表达情况,同时预测ssc-miR-149与细胞凋亡相关基因的靶向关系;然后利用JASPAR、PROMO、TargetScan、miRanda、RNAhybrid、DAVID等软件和NCBI、miRBase、Ensembl等数据库对ssc-miR-149进行转录因子结合位点预测、保守性分析、靶基因预测、GO富集分析和KEGG信号通路富集分析。结果表明,氧化应激组ssc-miR-149的表达量极显著下调;但过表达ssc-miR-149时,能极显著提高细胞活性,并抑制H_2O_2诱导的凋亡相关基因(Caspase-3、PUMA和FAS)的表达;ssc-miR-149启动子区域具有SP1、p53等多个转录因子结合位点,其靶基因显著富集于TNF信号通路、Rap1信号通路和NOD样受体信号通路等。由此推测,ssc-miR-149受到SP1等多种转录因子调控,它可能通过抑制TNF、Rap1和NOD信号通路中的靶基因PUMA、Caspase-9和FAF-1来调控猪颗粒细胞的凋亡,进而影响猪的卵泡发育。
关键词： ssc-miR-149 靶基因 生物信息学 颗粒细胞凋亡 卵泡闭锁
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甲基-CpG结合结构域蛋白2抑制PRRSV复制的研究
《河南农业大学学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为了研究甲基-CpG结合结构域蛋白2 (MBD2)在体外对猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的复制是否有抑制作用。首先,构建MBD2的3’-UTR报告质粒,通过双荧光素酶报告结果表明MBD2是miR-373靶基因。然后用MOI=1的PRRSV感染MARC-145细胞,在24、36、48 h后分别取样,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和Western blots试验进行检测。结果表明,PRRSV感染下调MBD2的mRNA和蛋白的表达水平。用真核表达载体pc DNA 3.1-Flag构建了MBD2的真核表达质粒pc DNA3. 1-Flag-MBD2,用pc DNA3. 1-Flag-MBD2转染MARC-145细胞,24 h后感染PRRSV,48 h后收获细胞。TCID50的试验结果表明,过表达MBD2能降低PRRSV滴度,而qRTPCR和Western blots的结果则表明MBD2能降低PRRSV的载量;相反,MBD2的siRNA试验表明,下调表达有利于PRRSV在MARC-145细胞复制。通过基因缺失试验,构建MBD2部分结构域缺失的表达质粒,最终发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制起关键的作用。研究结果表明,MBD2是拮抗PRRSV的宿主内源性蛋白,并发现MBD2的GR与MBD结构域可能在MBD2抑制PRRSV复制中起关键的作用,而PRRSV可能利用miR-373来下调MBD2的表达,从而逃逸宿主对病毒的清除。
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 甲基-CpG结合结构域蛋白2 miR-373
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不同增氧水平对夏玉米生长及氮素利用的影响
《核农学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为探究有利于夏玉米生长和氮素利用的适宜灌溉水溶解氧浓度,本试验以夏玉米为供试作物,采用地下滴灌供水方式,以地下水灌溉为对照,设置10(OA10)、20(OA20)和40(OA40)mg·L~(-1)灌溉水溶解氧浓度3个增氧水平,研究不同增氧水平对盆栽夏玉米生长、产量和氮素利用的影响。结果表明,增氧地下滴灌显著提高了土壤溶解氧浓度,与对照相比,OA40、OA20和OA10处理土壤溶解氧浓度平均提高14.83%、9.71%和8.00%,表现为作物生长增强,作物产量和氮素利用效率均显著提高(P<0.05)。与对照相比,OA10处理的株高、叶鲜质量和叶干质量分别增加7.39%、16.30%和12.02%;OA40处理叶干质量和茎鲜质量分别增加15.82%和12.43%;OA10、OA20和OA40根系鲜质量分别增加60.00%、17.66%和52.98%,根系体积分别增加34.03%、14.56%和51.32%;OA10和OA20处理根系活力分别增加272.77%和64.44%;OA10和OA40处理产量分别增加24.46%和21.83%,水分利用效率分别提高19.10%和21.61%,百粒重分别增加17.53%和15.14%。OA10和OA40处理籽粒氮素吸收量较对照分别增加63.90%和35.27%,OA10处理籽粒氮素分配比例和氮素吸收效率分别增加21.57%和33.33%。上述差异均具有统计学意义(P<0.05)。综上,增氧地下滴灌可显著提高作物根区溶解氧浓度,促进作物生长,提高产量及氮素吸收利用,以OA10处理效果最为显著。本研究结果为增氧灌溉技术在实际生产中的合理利用提供了理论依据。
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入侵云南草地贪夜蛾种群对5种常用Bt蛋白的敏感性评价
《植物保护 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda(J. E. Smith)是原分布于美洲大陆热带和亚热带地区的一种重要玉米害虫.在当地,种植抗虫转基因玉米是防控草地贪夜蛾危害的主要手段.该虫于2019年1月入侵我国云南省,为明确入侵我国云南的草地贪夜蛾种群对常用Bt蛋白的敏感性水平,本文通过饲料表面涂抹法测定了瑞丽草地贪夜蛾幼虫对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab以及Vip3A等5种Bt蛋白的敏感性.结果表明:几种常用Bt蛋白对瑞丽草地贪夜蛾致死作用顺序为Vip3A>Cry1Ab>Cry1F>Cry2Ab>Cry1Ac,对草地贪夜蛾抑制生长发育的顺序为Cry1Ab>Cry1F>Vip3A>Cry1Ac>Cry2Ab.此外,与美国相对敏感种群比较,云南瑞丽草地贪夜蛾种群对Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1F、Cry2Ab和Vip3A的敏感性指标在0.28~3.76之间,表明该入侵种群对此5种Bt蛋白均未产生抗性.此研究可为将来建立以转Bt基因玉米作为防控草地贪夜蛾的技术体系提供依据.
关键词： 草地贪夜蛾 人工饲料涂抹法 敏感性 Bt蛋白 生测
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猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性研究
《河南农业大学学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为测定猪链球菌对大环内酯类抗生素的耐药性和相关耐药基因分布特点,分析分离株对大环内酯类抗生素耐药的分子机制。从河南等7省份不同猪场采集来的疑似猪链球菌患病猪的脑脊液、关节液、肝等部位分离、纯化疑似菌落,采用镜检、16S rRNA基因方法鉴定猪链球菌。采用肉汤微量稀释法检测分离猪链球菌对大环内酯类抗生素红霉素、泰乐菌素、替米考星的耐药情况,采用PCR方法检测相关耐药基因(包括编码核糖体甲基化酶的erm基因ermA、ermB、ermC、ermTR和介导外排泵机制的mefA、mefE及msrD基因)分布情况。最终从573份病料分离鉴定出猪链球菌165株,分离率为28.8%。药敏试验结果显示:猪链球菌对大环内酯类抗生素耐药率高达98.1%,对红霉素、泰乐菌素、替米考星耐药率分别达96.9%、95.1%、94.5%,有153株菌株对3种抗生素同时耐药。耐药基因检测发现大环内酯类耐药基因ermA、ermB、ermC、ermTR、mefA、mefE、msrD检出率分别为5.4%、81.8%、13.3%、6.6%、11.5%、7.2%、5.4%,其中ermB检出率最高。除发现有93株菌株仅携带1个耐药基因外,分别有30、17、2、1个菌株分别携带2、3、4、6个大环内酯类耐药基因。在检出耐药基因的菌株中有82.5%(118/143)的菌株仅携带erm基因,有13.9%(20/143)的菌株同时携带erm以及mef、msr基因,另有3%(5/143)的菌株仅携mef、msr基因。猪链球菌对大环内酯类药物广泛耐药,大环内酯类耐药基因在猪链球菌中广泛分布,细菌的耐药性和菌株耐药基因携带情况基本呈正相关。以ermB介导的核糖体23S rRNA甲基化耐药机制占主导地位,由mefA、mefE、msrD介导的外排泵机制亦存在于分离菌株中。
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猪伪狂犬病毒gE蛋白的酵母表达及其单克隆抗体的筛选
《河南农业科学 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：为获得具有生物学活性的猪伪狂犬病毒(PRV)gE蛋白及其特异性单克隆抗体,利用电转技术将pPICZαA-gE重组质粒转入毕赤酵母X-33并筛选出阳性克隆,通过SDS-PAGE、Western blot鉴定筛选出PRV gE蛋白表达菌株.通过诱导表达获得gE分泌蛋白,并利用Ni柱进行纯化,应用Western blot、Dot blot、ELISA方法对纯化蛋白进行活性鉴定.同时将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠,细胞融合后通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)筛选单克隆抗体,并对单克隆抗体进行了反应性测定、效价测定及亚型鉴定.结果显示,PRV gE蛋白在毕赤酵母中成功表达,并获得了纯化蛋白,纯度达90%以上,且具有良好的生物学活性,与PRV阳性血清反应性良好;筛选到4株敏感性强、特异性良好的gE单克隆抗体,均可同时特异识别PRV gE蛋白及病毒,分别命名为2F10、4C10、9E1、10C3.综上,用酵母系统成功表达了PRV gE蛋白,并筛选到4株针对PRV gE蛋白的单克隆抗体.
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